Strona główna

1. 1zasada metody sekwencjonowania z zastosowaniem aparatu abi prism 310


Pobieranie 19.21 Kb.
Data19.06.2016
Rozmiar19.21 Kb.

Wykonywanie analizy genetycznej polimorfizmu genów



1.1ZASADA METODY SEKWENCJONOWANIA Z ZASTOSOWANIEM APARATU ABI PRISM 310


Znakowanie

Aby dokonać analizy sekwencji DNA przy użyciu aparatu ABI PRISM 310 stosuje się metodę sekwencjonowania cyklicznego (terminatorowego). Zasada tej metody polega na powielaniu (amplifikacji) w milionach kopii analizowanego fragmentu DNA (PCR) z zastosowanie specyficznych primerów. Następnie oczyszcza się produkty amplifikacji z primerów i przeprowadza się reakcje sekwencjonowania przy użyciu znakowanych fluorescencyjnie trójfosforanów didezoksyrybonukleotydów: ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP. Reakcja sekwencjonowania jest to tak naprawdę zmodyfikowana reakcja amplifikacji – PCR. Zasady przeprowadzenia reakcji PCR oraz szczegółowe instrukcje zawiera procedura SOP5006.



Elektroforeza

Otrzymane znakowane produkty amplifikacji o różnych długościach poddaje się procesowi elektroforezy w aparacie ABIPRISM 310 wyposażonym w kapilarę z nośnikiem polikrylamidowym o odpowiednich parametrach elektrolitycznych.



Detekcja

Kapilara podłączona jest do laserowego detektora, który wykrywa produkty sekwencjonowania znakowane terminalnymi nukleotydami o odpowiedniej barwie. Jest to kolor wirtualny (niebieski, zielony, żółty i czerwony), który przyporządkowany jest poszczególnych grup barwników:



  • 5-FAM, 6-FAM,

  • HEX, JOE, VIC

  • TAMRA, NED

  • PET, ROX

Zbieranie danych

Obserwacje rozdziału elektroforetycznego oraz zbieranie danych przeprowadza się w programie Data Collection


2.1.1 OGRANICZENIA METODY SEKWENCJONOWANIA

  • ryzyko fałszywie odczytanych (oznaczonych) nukleotydów wynikające z:

  • kontaminacja primerami pochodzącymi z amplifikacji poprzedzającej reakcję sekwencjo-nowania

  • kontaminacją DNA pochodzącym z innych amplifikacji

  • wrażliwości na substancje mające pływ na rozdział produktów sekwencjonowania w kapilarze i na odczyt sygnału fluorescencji.

  • zbyt duże stężenia nukleotydów użytych do reakcji sekwencjonowania

  • niewłaściwą korekcję matrycy - nakładanie się fluorescencji rożnych barwników pochodzących od różnych nukleotydów.

  • ryzyko negatywnych wyników powodowane może być:

  • zanieczyszczeniem próbek inhibitorami amplifikacji

  • użyciem niewłaściwych primerów i innych odczynników do amplifikacji

2.1.2 ZALETY

  • Czułość – pozwala na sekwencjonowanie niewielkich ilości materiału genetycznego

  • Uniwersalność poszukuje się nowych, nieopisanych mutacji w znanych genach.



1.2ZASADA METODY ANALIZY POLIMORFIZMÓW Z ZASTOSOWANIEM TRAWIENIA ENZYMAMI RESTYKCYJNYMI - RLFP


Amplifikacja

Powielanie w milionowych kopiach znanego fragmentu DNA z zastosowaniem primerów (krótkie fragmenty DNA – oligonukleotydy) komplementarnych do jednej z nici badanego DNA. Enzym polimeraza DNA może dobudować drugi komplemetarny do badanego fragment DNA tylko w obecności primerów. Sekwencje rozpoznawane przez pimery znajdują się zazwyczaj w odległości kilkuset par zasad, zatem powstający produkt ma taką długość, jaka odległość dzieli od siebie primery. Mieszanina w której zachodzi proces amplifikacji musi zawierać trójfosforany dezoksyrybonukleotydów: dATP, dCTP, dGTP, dTTP, które służą polimerazie za ‘cegiełki’ do budowy DNA. W mieszaninie reakcyjnej muszą znajdować się także jony metali K i Mg niezbędne dla pracy enzymu.



Elektroforeza kontrolna

Produkty amplifikacji poddaje się elektroforezie w żelu agarozowym ZAŁACZNIK 5006.2.9 aby sprawdzić poprawność reakcji PCR.



Trawienie enzymami restrykcyjnymi

Obecność mutacji lub analizowanego polimorfizmu genowego sprawdza się za pomocą trawienia enzymami restrykcyjnymi. Enzymy restrykcyjne rozpoznają odpowiednie miejsce restrykcyjne odpowiadające szukanej mutacji. Trawienie przeprowadza się w inkubatorze lub w łaźni wodnej, najczęściej przez noc.


Elektroforeza diagnostyczna


Po trawieniu enzymami restrykcyjnymi przeprowadza się kolejna elektroforeze w celu stwierdzenia produktów trawienia enzymami.

2.2.1 OGRANICZENIA METODY RLFP

  • zanieczyszczeniem próbek inhibitorami amplifikacji

  • użyciem niewłaściwych primerów i innych odczynników do amplifikacji

2.2.2 ZALETY



1.3ZASADA METODY ANALIZY POLIMORFIZMÓW – DYSKRYMINACJA ALLELI (SNP)


Definicja

Analiza dyskryminacji alleli służy do wykrywania w znanym genie, znanej mutacji (polimorfizmu) polegającej na zamianie (lub delecji) jednej zasady (nukleotydu), tak zwanego SNP (single nucleotide polymorphism). Do analizy dyskryminacji stosuje się metodę PCR w czasie rzeczywistym (RealTime PCR) polega na jednoczesnej amplifikacji fragmentu genu przy użyciu primerów/sond znakowanych znacznikami fluorescencyjnymi (najczęściej FAM i VIC). Sonda jest tak skonstruowana, ze rozpoznaje tylko fragment zawierający określony SNP. Podczas reakcji PCR w próbce amplifikują się tylko te fragmenty DNA, które są komplementarne do sondy. W wyniku amplifikacji powstają znakowane fluorescencyjnie produkty.



Zbieranie danych

Reakcje przeprowadza się w analizatorze RT-PCR (7900HT Fast Real Time System). Wyniki uzyskuje się danych uzyskanych w końcowym punkcie amplifikacji. W analizatorze przeprowadza się jednoczesna amplifikację wielu próbek ( płytka wielodołkowa), co pozwala na uzyskanie odczytu z wielu powtórzeń.



Wyniki

W wyniku analizy dyskryminacji alleli uzyskuje się rozkłady alleli w formie wykresów, na których próbki zawierające allel 1 (FAM), allel 2 (VIC) i zawijające oba allele (FAM i VIC) tworzą populację o określonych parametrach. Jest to odczyt sygnału fluorescencji o określonym natężeniu i długości fali emisji.



2.3.1 OGRANICZENIA METODY SNP

  • konieczność znania sekwencji badanego genu i analizowanej mutacji

  • konieczność analizy wielu próbek jednocześnie

  • cena – wysoki koszt aparatury i odczynników

2.3.1 ZALETY METODY SNP

  • szybkość – możliwość jednoczesnej analizy wielu próbek w krótkim czasie

1.4 SPEKTRUM DIAGNOSTYCZNE





ZASTOSOWANIE

PRZYKŁADY

KORZYŚCI

BADANIE PREDYSPOZYCJI GENETYCZNYCH TROMBOFILI

Polimorfizm G1691A genu czynnika V Leiden, G20210A genu czynnika II układu krzepnięcia,

Wykrywanie zaburzeń w układzie krzepnięcia

FARMAKOGENOMIKA

  • Oporność na leczenie lekami:

  • przeciwkrzepliwymi (pochodne warfaryny) - polimorfizm genu VKORC1 oksydazy-reduktazy witaminy K i cytochromu CYP2C9

  • przeciwpłytkowymi (pochodne tienopirydyny) – polimorfizm cytochromu CYP2C19

  • polimorfizm glikoproteiny płytkowej GPIIb/IIIa

Personalizacja leczenia, zmniejszenie ryzyka powikłań zakrzepowych i krwotocznych podczas leczenia

TRANSPLANTOLOGIA

Przeszczepy narządów

Typowanie HLA, szybsze i pewniejsze niż metody serologiczne

Analiza chimeryzmu



CHOROBY NOWOTWOROWE

Białaczki, dziedziczna forma raka sutka i jajnika

Szybkość, większa czułość niż metody cytogenetyczne, badanie mutacji genu BRCA1/BRCA2




©snauka.pl 2016
wyślij wiadomość