Strona główna

A machowska A. Analiza ekspresji genów. Analiza ekspresji wybranych genów w miazdze zdrowej I w stanie nieodwracalnego zapalenia


Pobieranie 118.63 Kb.
Data18.06.2016
Rozmiar118.63 Kb.
20111010A_ Machowska A. Analiza ekspresji genów.
Analiza ekspresji wybranych genów w miazdze zdrowej i w stanie nieodwracalnego zapalenia (na podstawie badań własnych).
Gene expression analysis in normal and irreversibly inflamed pulp tissue.

(based on own research)


Dr hab.n.med.Mansur Rahnama

Zakład Chirurgii Stomatologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie, ul. Karmelicka 7, Lublin;


Dr n. med. Anna Machowska

Gabinet stomatologiczny MediCare, ul. Mireckiego 13a lok.11, 05-300 Mińsk Mazowiecki, Tel. 667961167, annmach@interia.pl;


Lek.stom. Maria Kostro-Janaszek

Gabinet stomatologiczny MediCare, ul. Mireckiego 13a lok.11, 05-300 Mińsk Mazowiecki, Tel. 667961167;


Kierownik jednostki: dr hab.n.med. Mansur Rahnama
Streszczenie w j.pol.
Wprowadzenie. Próchnica zębów zaliczana jest do chorób cywilizacyjnych. Jest ona częstą przyczyną stanów zapalnych miazgi. Powszechnie używane testy do określania stanu miazgi okazują się nie być precyzyjne, stąd coraz większe zainteresowanie badaniami genetycznymi.

Celem pracy była ocena ekspresji genów interleukiny-1alfa (Il-1alfa), interleukiny-2 (Il-2) oraz pierwszej adhezyjnej cząsteczki śródbłonka naczyniowego (VCAM-1) w miazdze zębów zdrowych i w miazdze w czasie jej nieodwracalnego zapalenia. Zbadano zależności między ekspresją tych genów a stanem miazgi oraz wpływem czynników dodatkowych takich, jak: stłoczenia zębów, braki skrzydłowe, przeciążenie zębów w zgryzie .

Materiał i metody. Badania zostały przeprowadzone na dwóch grupach pacjentów:


  1. grupie badanej utworzonej przez 30 pacjentów - zęby leczone kanałowo w znieczuleniu miejscowym z powodu nieodwracalnego zapalenia miazgi (pulpitis drugiego stopnia),

  2. grupie kontrolnej złożonej z 30 pacjentów ogólnie zdrowych, leczonych ortodontycznie z powodu wady zgryzu - wykonano ekstrakcje zębów przedtrzonowych lub trzecich trzonowych, a następnie z każdego ekstyrpowano miazgę do badań genetycznych.

Ekspresje genów badano metodą PCR w czasie rzeczywistym.
Wyniki. Wykazano, że ekspresja genów zależy od stanu miazgi.

Stwierdzono istotny statystycznie wyższy poziom ekspresji genów Il-2 oraz VCAM-1 w grupie zdrowej. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między ekspresją Il-1alfa w obu grupach.

Podsumowanie. Badania wykazują, że miazga zębów stłoczonych lub przeciążonych w zgryzie , mimo braku klinicznych objawów zapalenia, nie jest zdrowa. Wady zgryzu lub zgryz urazowy predysponują do wystąpienia zapalenia.
Summary
Introduction. Clinical assessment of dental pulp involves numerous diagnostic tests. However, with a rapid science and technology advancement, genetic research generates increasing interest.

Aim of study. The research was aimed determination of expression of IL-1alpha, IL-2 and VCAM-1 in normal teeth and in teeth with irreversibly inflamed pulp.

Material and methods. The study was conducted in two groups of patients: Study group consisting of 30 patients – teeth treated endodontically with local anaesthesia due to irreversibly inflamed pulp and control group consisting of 30 generally healthy patients orthodontically treated due to malocclusion .

Genes expression was analised in real time in PCR method.

Results. There is a correlation between IL-alpha 1,IL-2, VCAM-1 and condition of pulp. Additional factors such as crowding ,overload caused by malocclusion or posterior teeth losses, affect the condition of pulp. Statistically significant, higher level of Il-2 and VCAM-1 expression was found in the control group. No statistically significant differences were observed in IL-1alpha expression between both groups.

Conclusions. The studies indicated that the pulp tissue in teeth, which are crowded or overloaded due to malocclusion, in spite of clinical signs inflammation, may not be perceived as normal. Dental crowding and traumatic occlusion increase the predisposition for development of pulp inflammatory condition.


20111010B_ Machowska A. Analiza ekspresji genów.
Analiza ekspresji wybranych genów w miazdze zdrowej i w stanie nieodwracalnego zapalenia (na podstawie badań własnych)
Streszczenie w j.pol.
Wprowadzenie. Próchnica zębów zaliczana jest do chorób cywilizacyjnych. Jest ona częstą przyczyną stanów zapalnych miazgi. Powszechnie używane testy do określania stanu miazgi okazują się nie być precyzyjne, stąd coraz większe zainteresowanie badaniami genetycznymi.

Celem pracy była ocena ekspresji genów interleukiny-1alfa (Il-1alfa), interleukiny-2 (Il-2) oraz pierwszej adhezyjnej cząsteczki śródbłonka naczyniowego (VCAM-1) w miazdze zębów zdrowych i w miazdze w czasie jej nieodwracalnego zapalenia. Zbadano zależności między ekspresją tych genów a stanem miazgi oraz wpływem czynników dodatkowych takich, jak: stłoczenia zębów, braki skrzydłowe, przeciążenie zębów w zgryzie.

Materiał i metody.Badania zostały przeprowadzone na dwóch grupach pacjentów:


  1. grupie badanej utworzonej przez 30 pacjentów - zęby leczone kanałowo w znieczuleniu miejscowym z powodu nieodwracalnego zapalenia miazgi (pulpitis drugiego stopnia),

  2. grupie kontrolnej złożonej z 30 pacjentów ogólnie zdrowych, leczonych ortodontycznie z powodu wady zgryzu - wykonano ekstrakcje zębów przedtrzonowych lub trzecich trzonowych, a następnie z każdego ekstyrpowano miazgę do badań genetycznych.

Ekspresje genów badano metodą PCR w czasie rzeczywistym.

Wyniki. Wykazano, że ekspresja genów zależy od stanu miazgi.

Stwierdzono istotny statystycznie wyższy poziom ekspresji genów Il-2 oraz VCAM-1 w grupie zdrowej. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między ekspresją Il-1alfa w obu grupach.

Podsumowanie. Badania wykazują, że miazga zębów stłoczonych lub przeciążonych w zgryzie , mimo braku klinicznych objawów zapalenia, nie jest zdrowa. Wady zgryzu lub zgryz urazowy predysponują do wystąpienia zapalenia.


Sumary
Introduction.Clinical assessment of dental pulp involves numerous diagnostic tests. However, with a rapid science and technology advancement, genetic research generates increasing interest.

Aim of study.The research was aimed determination of expression of IL-1alpha, IL-2 and VCAM-1 in normal teeth and in teeth with irreversibly inflamed pulp.

Material and methods.The study was conducted in two groups of patients: Study group consisting of 30 patients – teeth treated endodontically with local anaesthesia due to irreversibly inflamed pulp and control group consisting of 30 generally healthy patients orthodontically treated due to malocclusion .

Genes expression was analised in real time in PCR method.

Results. There is a correlation between IL-alpha 1,IL-2, VCAM-1 and condition of pulp .Additional factors such as crowding ,overload caused by malocclusion or posterior teeth losses ,affect the condition of pulp .Statistically significant , higher level of Il-2 and VCAM-1 expression was found in the control group. No statistically significant differences were observed in IL-1alpha expression between both groups.

Conclusions. The studies indicated that the pulp tissue in teeth , which are crowded or overloaded due to malocclusion , in spite of clinical signs inflammation , may not be perceived as normal. Dental crowding and traumatic occlusion increase the predisposition for development of pulp inflammatory condition.


Hasła indeksowe

próchnica zębów, zapalenie miazgi, ekspresja genów, cytokiny


Key words

dental caries, pulpitis, genes expression, cytokines



Wstęp

Miazga zęba jest tkanką miękką pochodzenia mezenchymalnego. Zamknięta jest w jamie zęba, z czego wynikają jej specyficzne właściwości. Do jej oceny w badaniu klinicznym stosuje się wiele testów diagnostycznych. Przydatność tych metod oraz porównanie ich wyników z faktycznym stanem miazgi można ocenić za pomocą badań histologicznych. Jednak przy tak szybkim rozwoju nauki i techniki coraz większe zainteresowanie budzą badania genetyczne.

Rodzaj bólu charakteryzuje określone stany chorobowe, a to z kolei ma wpływ na wybór metody leczenia. W przypadku stwierdzenia choroby miazgi może być to leczenie endodontyczne lub ekstrakcja zęba. Jednak często pacjent ma problem z określeniem dolegliwości, a tym samym lekarz stomatolog może mieć trudność z postawieniem diagnozy.

Opracowanie odpowiednich testów genetycznych może być dodatkowym narzędziem dla stomatologa. Określenie, które geny są aktywowane w czasie zapalenia miazgi, a także znalezienie czynników, które mają na to wpływ, daje pacjentowi szansę na uniknięcie niepotrzebnego leczenia.1

W pracy podjęto próbę określenia, które geny są aktywowane w czasie zapalenia miazgi i jakie czynniki mają na to wpływ.

Do badania wybrano geny : interleukinę 1 alfa (Il-1 alfa), interleukinę 2 (Il-2) oraz pierwszą adhezyjną cząsteczkę śródbłonka naczyniowego (VCAM-1).

Dokonano porównania ekspresji tych genów w miazdze zdrowej oraz w stanie nieodwracalnego zapalenia.

Ważniejsze funkcje badanych genów

Interleukina 1 ma zdolność aktywacji komórek śródbłonka, co powoduje wzrost ekspresji cząsteczek adhezyjnych, przylegania granulocytów i makrofagów do ścian naczyń (związane z VCAM-1), wydzielanie dodatkowych cytokin i czynników wzrostu, produkcję tlenku azotu (NO) i sprzyja krzepnięciu krwi.2, 3, 4, 5, 6, 7

Procesy, które pobudza interleukina 2, to: proliferacja limfocytów regulatorowych, limfocytów T cytotoksycznych, proliferacja i różnicowanie limfocytów B, aktywacja i proliferacja komórek NK.3, 7

VCAM-1 po raz pierwszy została zidentyfikowana jako białko, które pojawia się na powierzchni komórek śródbłonka po ekspozycji na cytokiny prozapalne. Następuje wtedy pobudzenie wytwarzania limfocytów B i aktywacja leukocytów. Przez interakcje z receptorem VLA-4 indukuje reakcje immunologiczne, co odgrywa znaczącą rolę w zapoczątkowaniu stanu zapalnego i odpowiedzi immunologicznej.3, 8, 9, 10, 11

Ekspresja genów


Określenie poziomu ekspresji genów w zdrowej tkance służy do analizy i interpretacji wyników w tkance zmienionej zapalnie. W badaniu wykorzystano porównawczą metodę wyznaczania ekspresji genów z zastosowaniem genu kontrolnego (referencyjnego) GAPDH (gen kodujący dehydrogenazę aldehydu 3-fosfoglicerynowego). Aby gen referencyjny był właściwym wzorcem musi charakteryzować się stałym poziomem ekspresji w danej tkance niezależnie od warunków doświadczalnych i stanu chorobowego oraz zbliżoną liczbą transkryptów w stosunku do genu badanego.

Poziom ekspresji badanego genu został obliczony jako różnica między wartością ekspresji badanego genu a GAPDH.

Im mniejsza uzyskana wartość, tym większa ekspresja badanego genu.12
Ekspresja względna

Metoda umożliwia ilościowe określenie w jaki sposób zmienia się ekspresja badanego genu względem grupy kontrolnej czyli kalibratora. Jest to próba o stałym stosunku ilości transkryptów genu badanego i referencyjnego.

Ekspresję względną można obliczyć według wzoru:

RQ = 2 – (dCt genu – dCt kalibratora)

dCt kalibratora – próba kontrolna o najbardziej niezmiennej ekspresji badanego genu.12
Przeprowadzone badania miały na celu oznaczenie ekspresji genów Il-1alfa, Il-2 oraz VCAM-1 w zębach zdrowych i z miazgą w stanie nieodwracalnego zapalenia (pulpitis drugiego stopnia).

Założeniem pracy było wykazanie zależności między ekspresją tych genów a stanem miazgi. Ocena ekspresji genów Il-1alfa, Il-2oraz VCAM-1 w grupie badanej i kontrolnej miały na celu uzyskanie odpowiedzi na pytania:



  1. Czy ekspresja genów Il-1alfa, Il-2 oraz VCAM-1 zależy od stanu miazgi?

  2. Czy istnieje zależność między ekspresją poszczególnych genów (Il-1alfa, Il-2, VCAM-1)?

  3. Czy czynniki dodatkowe, takie jak stłoczenia zębów lub braki skrzydłowe, mają wpływ na stan miazgi, a tym samym na ekspresję genów Il-1alfa, Il-2 oraz VCAM-1?

  4. Czy ekspresja genów Il-1alfa, Il-2 oraz VCAM-1 różni się w grupie kontrolnej i badanej?


Materiał i metody

Badania zostały przeprowadzone na dwóch grupach pacjentów:



  1. grupie badanej (P) utworzonej przez 30 pacjentów - zęby leczone kanałowo w znieczuleniu miejscowym z powodu nieodwracalnego zapalenia miazgi (pulpitis drugiego stopnia),

  2. grupie kontrolnej (N) złożonej z 30 pacjentów ogólnie zdrowych, leczonych ortodontycznie z powodu wady zgryzu - wykonano ekstrakcje zębów przedtrzonowych lub trzecich trzonowych bez klinicznych cech objawów zapalenia, a następnie z każdego ekstyrpowano miazgę do badań genetycznych.

Analizie została poddana ekspresja genów Il-1, Il-2 oraz VCAM-1 w miazdze zdrowej i w stanie zapalenia. Na podstawie stomatologicznego badania klinicznego pacjenci byli kwalifikowani do odpowiedniej grupy.

Miazgę po ekstyrpacji w obu grupach umieszczano w roztworze RNAlater (AppliedBiosystems), a następnie przeprowadzano badania genetyczne-izolację RNA z miazgi zębów, oznaczenie ilościowe i jakościowe RNA, badanie ekspresji genów metodą PCR w czasie rzeczywistym.

Otrzymane wyniki zostały poddane analizie statystycznej z zastosowaniem programu Statistica V.8.

Wyniki


  1. Ekspresja genów Il-1alfa, Il-2 oraz VCAM-1 zależy od stanu miazgi.

  2. Oznaczona ekspresja względna badanych genów wykazała, że korelacja między Il-1alfa a Il-2 w grupie badanej jest istotna i prawie pełna. Korelacja między ekspresją względną Il-1alfa oraz VCAM-1 w grupach razem jest istotna i wysoka.

  3. Czynniki dodatkowe takie jak: stłoczenia, przeciążenie w zgryzie spowodowane przez wadę zgryzu lub braki skrzydłowe, mają wpływ na stan miazgi zęba.

  4. Stwierdzono istotny statystycznie wyższy poziom ekspresji Il-2 oraz VCAM-1 w grupie zdrowej. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic między poziomem ekspresji Il-1alfa w obu grupach.


Omówienie wyników i dyskusja

Okazuje się, że zęby przeciążone w zgryzie oraz podczas leczenia ortodontycznego wykazują nieprawidłową reakcję na większość stosowanych testów klinicznych. Alomari i wsp. stwierdzili, że reakcja zębów na bodźce termiczne i elektryczne u pacjentów ze stałymi aparatami ortodontycznymi jest negatywna. Zęby reagowały prawidłowo dopiero po około dwunastu miesiącach retencji.13 Cave i wsp. odkryli podobną zależność w przypadku reakcji na bodźce termiczne.14 Większość autorów jest zgodna, że do oceny żywotności miazgi należy stosować badanie przepływu krwi w jej naczyniach przepływomierzem Dopplera. Uważają, że jest to metoda obiektywna. Natomiast reakcja miazgi na bodźce termiczne lub elektryczne często daje błędny wynik (tj. fałszywie dodatni lub fałszywie ujemny), a z tego wynika nieprawidłowa diagnoza. Można to zaobserwować w przypadku zębów stłoczonych i przeciążonych w zgryzie.15 Być może dlatego część autorów sugeruje konieczność wprowadzenia zmian w dotychczas stosowanych klasyfikacjach chorób miazgi. Większość z nich opiera się na przesłankach histopatologicznych. Jednak wykazano znaczną niezgodność między obrazem klinicznym, a histopatologicznym.16 W Polsce obowiązuje obecnie klasyfikacja symptomatologiczno-terapeutyczna chorób miazgi.17

Wiele nadziei wiąże się także z odkryciem, iż źródłem komórek macierzystych mogą być zęby mleczne. Komórki te mają tworzyć kompleks podobny do zębiny i miazgi (dentine-pulp-like complex). Trwają badania nad ich wykorzystaniem do leczenia chorób przyzębia i miazgi, a w przyszłości być może do” wyprodukowania” zębów.18,19

W przeprowadzonej ocenie stanu miazgi zastosowano test termiczny, na opukiwanie oraz ocenę zęba za pomocą wzroku (obecność ubytku, jego rozległość i głębokość). Pacjenci byli proszeni o odpowiedzi na pytania dotyczące bólu (czas trwania, nasilenie). Ważna była analiza warunków zgryzowych (stłoczenia, braki skrzydłowe, uraz zgryzowy, wada klasy drugiej lub trzeciej). Z badań dodatkowych wykonano zdjęcia zębowe lub pantomograficzne. Było to podstawą klasyfikacji pacjentów do grupy badanej i kontrolnej.

Otrzymane wyniki wykazały, że poziom ekspresji (dCt) Il-2 oraz VCAM-1 są istotnie wyższe w miazdze teoretycznie uznanej za zdrową. Natomiast w przypadku ekspresji Il-1alfa jego wartość nie miała istotnej statystycznie różnicy między grupami. Pozwoliło to na wyciagnięcie wniosku, że wyżej wymienieni autorzy słusznie sugerują zawodność powszechnie używanych testów do oceny stanu miazgi. Zwraca to również uwagę na konieczność głębszej analizy stosunków zwarciowych. Badania jednoznacznie wskazują, że miazga zębów stłoczonych lub przeciążonych w zgryzie, mimo że klinicznie brak jej objawów zapalenia, nie jest zdrowa. Lekarze stomatolodzy powinni większy nacisk kłaść na profilaktykę oraz uświadomić pacjentom jak ważne jest leczenie ortodontyczne i protetyczne. Pomoże to również uniknąć niepotrzebnego leczenia zachowawczego (leczenie endodontyczne).

Wnioski te pokrywają się z przedstawionymi przez autorów, którzy badali obraz histologiczny miazgi zębów usuniętych z przyczyn ortodontycznych. Na podstawie badania klinicznego stwierdzono, że zęby nie wykazują cech stanu zapalnego. Natomiast badanie histologiczne ujawniło, że w większości analizowanych preparatów występowały jego oznaki. Wynika stąd, że stłoczenia zębów i zgryz urazowy predysponują do jego wystąpienia.20

Oznaczona ekspresja względna badanych genów nie wykazała istotnych statystycznie różnic. Utrzymuje się ona na podobnym poziomie w obu grupach. Interesująca jest korelacja między ekspresją względną (RQ) Il-1alfa oraz Il-2 w grupie badanej-jest ona istotna i prawie pełna. Oznacza to, że aktywacja genów Il-1alfa oraz Il-2 jest ze sobą powiązana. Cytokiny te współdziałają ze sobą podczas zapalenia, stąd między ekspresją ich genów występuje zależność. Il-1 alfa bierze udział w syntezie Il-2 oraz jej receptora na limfocytach T. Obie interleukiny mają wpływ na funkcje limfocytów B, takich jak: ich proliferacja i różnicowanie oraz wytwarzanie przeciwciał. Potwierdza to doniesienia autorów, którzy uważają Il-2 za marker zapalenia.21 Według innych badaczy u pacjentów z nieodwracalnym zapaleniem miazgi można zaobserwować wzrost ilości makrofagów, limfocytów B i T, a także gęstości naczyń w miazdze, a komórki obronne reagują na zapalenie wydzielając cytokiny i chemokiny. Zwiększona ekspresja VCAM-1 wynikała z działania m.in.Il-1. Takich zmian dowodzą nie tylko autorzy badający zęby, ale także reakcje alergiczne (alergia pokarmowa) czy przewlekłe zapalenie żołądka.22,23 W przypadku uzyskanych wyników korelacja między RQ Il-1alfa, a RQ VCAM-1 w obu grupach razem jest istotna i wysoka. Potwierdza to, że w miazdze przeciążonych zębów występują ogniska zapalenia.

Należy zadać pytanie czy stłoczenia zębów i zgryz urazowy nie są przyczyną zmian zapalnych w miazdze. Ocena kliniczna zębów z grupy kontrolnej sugerowała, że są one zdrowe. Jednak badania genetyczne wskazują na podwyższony poziom Il-1alfa, Il-2 oraz VCAM-1. Może mieć to niebagatelne znaczenie dla postępowania z pacjentami i dalsze leczenie zachowawcze, ortodontyczne lub protetyczne.

Przeprowadzone badania opierają się na próbie określenia, jakie geny są aktywowane podczas zapalenia miazgi oraz jakie czynniki są za to odpowiedzialne. Uważamy, że w dalszych badaniach należy zająć się problemem czynników sprzyjających podwyższeniu poziomu cytokin w zębach, które klinicznie nie wykazują cech zapalenia. Należy również zastanowić się nad wyborem pacjentów ortodontycznych do grupy kontrolnej dla przeprowadzanych badań, ponieważ miazga ich zębów również wykazywała cechy zapalenia (bezobjawowego). Lekarze stomatolodzy powinni większą uwagę przykładać do analizy stosunków zwarciowych, a także tłumaczyć pacjentom jakie skutki może mieć zaniechanie leczenia ortodontycznego lub protetycznego. Podkreśla to jak duże znaczenie w stomatologii ma profilaktyka.

Badania są nowatorskie i do tej pory napisano niewiele doniesień naukowych poświęconych aktywacji poszczególnych genów w stanach zapalnych miazgi oraz w miazdze uznanej klinicznie za zdrową. Temat ten na pewno będzie rozwijany i umożliwi to wówczas szerszą dyskusję.


Intoduction

Dental pulp is soft tissue of mesenchymal origin. Being confined in the pulp cavity, it shows specific properties. Clinical assessment of dental pulp involves numerous diagnostic tests. Usefulness of these methods as well as comparison of their outcomes to the actual condition of the pulp may be evaluated by histology testing. However, with a rapid science and technology advancement, genetic research generates increasing interest.


Individual conditions are characterised by the nature of pain, which, subsequently, influences the choice of a treatment modality. In case of a dental pulp disease, it may signify endodontic treatment or tooth extraction. However, a patient often finds it difficult to determine the discomfort and, consequently, establishment of the diagnosis may be challenging. Development of suitable genetic assays may constitute an additional instrument for a dental surgeon. Determination of genes activated during pulpitis as well as factors affecting the activation give the patient a chance to avoid unnecessary treatment.1
This study attempted to determine, which genes are activated during pulpitis and which factors influence the process.

The following genes were selected for the research: interleukin 1 alpha (Il-1 alpha), interleukin 2 (Il-2), and vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1).

Expression of the selected genes was compared in normal and irreversibly inflamed pulp.
Major functions of the investigated genes

Interleukin 1 has the ability to activate endothelial cells, which induces increased expression of adhesive molecules, adhesion of granulocytes and macrophages to the vascular walls (associated with VCAM-1), secretion of additional cytokines and growth factors, production of nitric oxide (NO), and facilities blood coagulation.2,3,4,5,6,7

The processes stimulated by interleukin 2 include proliferation of regulatory lymphocytes, cytotoxic T lymphocytes, proliferation and differentiation of B lymphocytes as well as activation and proliferation of natural killer (NK) cells.3,7
For the first time VCAM-1 was identified as protein found on the surface of endothelial cells following exposition to pro-inflammatory cytokines. Production of B leukocytes is stimulated at that time and leukocytes are activated. VCAM-1 induces immunological reactions via interactions with the VLA-4 receptor. The process plays a significant role in initiation of the inflammatory conditions as well as immunological response.3,8,9,10,11
Gene expression
Determination of the level of gene expression in normal tissue serves for analysis and interpretation of outcomes in the tissue affected by inflammation. The study also applied a comparative method for determination of gene expression with the use of the control (reference) gene: GAPDH (gene coding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase). To constitute an adequate model, the reference gene must be characterised by a constant expression level in the tissue (regardless of the experimental environment and pathological condition) as well as similar number of transcripts compared to the investigated gene.

The expression level of the investigated gene was calculated as the difference between the values of expression of the investigated gene and GAPDH.

The lower the value obtained the higher expression of the investigated gene.12

Relative expression.

The method allows quantitative determination of the manner the investigated gene expression changes versus the control group, i.e. the calibrator. It is a sample of constant transcript number ratio of the investigated gene over the reference gene.

Relative expression may be calculated based on the following formula:

RQ = 2 – (gene dCt – calibrator dCt)

Calibrator dCt – control sample with the most stable expression of the investigated gene.12


The research was aimed at determination of expression of Il-1alpha, Il-2, and VCAM-1 in normal teeth and in teeth with irreversibly inflamed pulp (second grade pulpitis).
The study was designed to demonstrate correlation between expression of the genes and condition of the pulp. Assessment of expression of Il-1alpha, Il-2, and VCAM-1 in the study group and the control group were aimed at finding answers for the following questions:

  1. Does expression of Il-1alpha, Il-2, and VCAM-1 depend on condition of the pulp?

  2. Is there a correlation between expression of individual genes (Il-1alpha, Il-2, VCAM-1)?

  3. Do additional factors, such as dental crowding or posterior tooth losses, affect the condition of the pulp, and consequently expression of Il-1alpha, Il-2, and VCAM-1?

  4. Are there any differences of Il-1alpha, Il-2, and VCAM-1 expression between the control group and study group?


Material and methods

The study was conducted in two groups of patients:



  1. Study group (P) consisting of 30 patients – teeth treated endodontically with local anaesthesia due to irreversibly inflamed pulp (second grade pulpitis);

  2. Control group (N) consisting of 30 generally healthy patients orthodontically treated due to malocclusion – extraction of premolars or third molars with no clinical signs of inflammation; pulp tissue was extirpated from each of the extracted teeth for genetic testing.

The analysis concerned expression of Il-1alpha, Il-2, and VCAM-1 in normal and inflamed dental pulp. Based on a dental clinical examination the patients were qualified to an adequate group.

In both groups extirpated pulp was placed in the RNAlater solution (AppliedBiosystems), and then genetic testing was performed – pulp RNA isolation, quantity and quality RNA determination, and real time PCR gene expression analysis.

The obtained results were statistically analysed with Statistica V.8 programme.
Results


  1. Expression of Il-1alpha, Il-2, and VCAM-1 depends on the condition of pulp tissue.

  2. Determined relative expression of the investigated genes indicated that correlation between Il-1alpha and Il-2 in the study group is significant and nearly complete. Correlation between relative expression of Il-1alpha and VCAM-1 in the two groups jointly is both, significant and high.

  3. Additional factors such as crowding, overload caused by malocclusion or posterior teeth losses, affect the condition of pulp.

  4. Statistically significant, higher level of Il-2 and VCAM-1 expression was found in the control group. No statistically significant differences were observed in Il-1alpha expression between both groups.


Discussion

It appears that teeth overloaded due to malocclusion or orthodontic treatment show abnormal reaction to most of the clinical tests. Alomari et al. found that reaction of teeth to thermal and electric stimuli in patients with fixed orthodontic appliances is negative. The teeth reacted in a correct manner not until approximately twelve months of retention were completed.13 Cave et al. discovered a similar correlation in case of reaction to thermal stimuli.14 Majority of authors agree that assessment of pulp vitality requires blood flow test in its vessels with a Doppler blood flowmeter. The method is considered unbiased. Whereas the reaction of pulp to thermal or electric stimuli often produces an incorrect result (false positive or false negative) leading to an incorrect diagnosis. It may be observed in case of crowded teeth and overloaded teeth due to malocclusion.15 Perhaps this is the reason why some authors suggest the necessity of introducing changes in previously used classifications of pulp diseases. Majority of them draw their conclusions based on histopathology rationale. However, a considerable discrepancy was found between the clinical picture and histopathological picture.16 In Poland the symptomatic – therapeutic classification of pulp diseases is the binding one.17


The discovery that the primary teeth may constitute a source of stem cells is considered very promising. The cells may form the dentine-pulp-like complex. The research on their use in diseases of periodontium and pulp is still in progress. In the future, studies on ‘production’ of new teeth might be possible.18,19

The assessment of the pulp condition employed a thermal test, percussion test, and visual assessment of the tooth (the presence of cavity, its range and depth). Patients were asked to answer questions in regard of pain (duration and severity of pain). The analysis of occlusion status was important (crowding, posterior teeth losses, traumatic occlusion, class II or III malocclusion). Additional testing included dental images or orthopantomograms (OPGs). It constituted the base for classification of patients to the study group and control group. The obtained results indicated that the level of expression (dCt) of Il-2 and VCAM-1 is significantly higher in the pulp, which was theoretically considered normal. However, in case of expression of Il-1alpha, there was no statistically significant difference between the groups. It allowed drawing a conclusion that the authors mentioned above rightly suggested unreliability of the commonly used tests for pulp condition assessment. It also implies the necessity of more thorough analysis of occlusal relationships. The studies unequivocally indicated that the pulp tissue in teeth, which are crowded or overloaded due to malocclusion, in spite of no clinical signs of inflammation, may not be perceived as normal. Dental surgeons should place more emphasis on prevention and make patients realise how important orthodontic and prosthetic treatment is. It will also help to avoid unnecessary conservative treatment (endodontic treatment).


The conclusions are consistent with the ones presented by the authors mentioned above, who investigated the histopathological picture of the pulp tissue from teeth extracted due to orthodontic reasons. Clinical examination showed there were no symptoms of inflammation in the teeth. However, histopathology testing revealed that majority of the analysed specimens showed signs of inflammation. It implies that dental crowding and traumatic occlusion increase the predisposition for development of this condition.20
The determined relative expression of the investigated genes did not show statistically significant differences. It is maintained at similar level in both groups. An interesting issue was the correlation between relative expression (RQ) of Il-1 alpha and Il-2 in the study group – it was significant and nearly complete. It signifies that activation processes of Il-1alpha and Il-2 are mutually related. The cytokines cooperate with each other during inflammation; hence the correlation between expression of their genes. Il-1alpha participates in synthesis of Il-2 and Il-2 receptor on T lymphocytes. Both interleukins influence the function of B lymphocytes such as their proliferation and differentiation as well as production of antibodies. It confirms the reports of other authors, who considered Il-2 an inflammation marker.21 According to other researchers patients with irreversible pulpitis show increased macrophages, B and T lymphocytes counts, as well as increased vessel density in the pulp tissue and the protective cells react to inflammation with secretion of cytokines and chemokines. Increased expression of VCAM-1 resulted from activity of Il-1, among other factors. Such changes were demonstrated not only by authors investigating teeth but also allergic reactions (food allergy) or chronic stomatitis.22,23 In case of results obtained in our research, the correlation between RQ of Il-1alpha and RQ of VCAM-1 in the two groups jointly was both, significant and high. It confirms the assumption that the pulp tissue of overloaded teeth develops inflammatory foci.
The necessary question to be asked is whether or not dental crowding and traumatic occlusion are the reasons of inflammatory lesions within the pulp tissue. Clinical assessment of teeth in the control group suggested that they are normal. However, genetic testing indicated increased levels of Il-1alpha, Il-2, and VCAM-1. It may have considerable significance for patient management and further conservative, orthodontic or prosthetic treatment.

The discussed study was based on an attempt to determine, which genes are activated during pulpitis and which factors are responsible for the process. We believe that further research should investigate the problem of factors promoting increased levels of cytokines in teeth showing no clinical signs of inflammation. Another issue to consider is the selection of orthodontic patients to the control group as their pulp tissue also showed signs of inflammation (asymptomatic). Dental surgeons should pay more attention to the analysis of occlusal relationships as well as provide patients with explanation on consequences of neglected orthodontic or prosthetic treatment. The conclusion emphasises the significance of prevention in dentistry.


This type of research is innovative and there were few scientific reports so far, which concerned activation of individual genes in inflammatory conditions of dental pulp and dental pulp clinically considered as normal. The presented issue will certainly be elaborated on, which will allow wider discussion.
Piśmiennictwo:


  1. Skórska-Jasak A: Analiza przyczyn bólu zęba i metod leczenia w nagłych przypadkach stomatologicznych. Dent. Med. Probl. 2006, 43, 2, 233 – 238.

  2. Barkhardar RA, Ghani QP, Russell TR, Hussain MZ: Interleukin-1 beta activity and collagen synthesis in human dental pulp fibroblasts. J Endod. 2002 Mar; 28 (3): 157-9.

  3. Gołąb J, Jakóbisiak M, Lasek W, Stokłosa T: Immunologia. PWN, Warszawa 2008, s.110-117.

  4. Graves BJ, Hatada MH, Hedrickson WA, Miller JK, Madison VS, Satow Y: Structure of interleukin 1 alpha. Biochemistry, 1990 Mar 20; 29 (11): 2679-84.

  5. Kumar S, Millis AJ, Baglioni C: Expression of interleukin 1- inducible genes and production of interleukin 1 by aging human fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1992 May 15; 89 (10): 4683-7.

  6. Robbins: Patologia. Wydanie I polskie pod redakcją Włodzimierza T Olszewskiego, Urban & Partner Wrocław 2005, s.36-56.

  7. Zahorska-Markiewicz B, Małecka – Tendera E: Patofizjologia kliniczna dla studentów medycyny. Volumed Wrocław 2001, s.111-112.

  8. Polte T, Newman W, Raghunathan G, Gopal TV: Structural and functional studies of full-length vascular cell adhesion molecule-1: internal duplication and homology to several adhesion proteins. DNA Cell Biol. 1991 Jun; 10 (5): 349-57.

  9. Marui N, Offermann MK, Swerlick R, Kunsch C, Rosen CA, Ahmad M, Alexander RW, Medford RM: Vascular cell adhesion molecule -1 (VCAM-1) gene transcription and expression are regulated through an antooxidant-sensitive mechanism in human vascular endothelial cells. J Clin Invest. 1993 Oct;92 (4): 1866-74.

  10. Iademarco MF, McQuillan JJ, Dean DC: Vascular cell adhesion molecule 1: contrasting transcriptional control mechanisms in muscle and endothelium. Proc Natl Acad Sci USA. 1993 May 1; 90(9): 3943-7.

  11. Iademarco MF, McQuillan JJ, Rosen GD, Dean DC: Characterization of the promoter for vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1). J Biol Chem. 1992 Aug 15; 267 (23): 16323-9.

  12. Romanowski T, Markiewicz A, Bednarz N, Bielawski KP: Geny metabolizmu podstawowego jako geny referencyjne w ilościowym oznaczaniu ekspresji genów metodą real - time PCR. Postepy Hig Med Dosw. (online), 2007; 61: 500-510.

  13. Alomari FA, Al-Habahbeh R, Alsaharna BK: Responses of pulp sensibility tests during orthodontic treatment and retention. Int Endod J. 2011 Mar 2.

  14. Cave SG, Freer TJ, Padlich HM: Pulp test responses in orthodontic patients. Aust Orthod J. 2002 Mar; 18 (1): 27-34.

  15. Abd-Elmequid A, Yu DC: Dental pulp neurophysiology: part 2. Current diagnostic tests to assess pulp vitality. J Can Dent Assoc. 2009 Mar; 75 (2): 139-43.

  16. Abbott PV, Yu C: A clinical classification of the status of the pulp and the root canal system. Aust Dent J. 2007 Mar; 52 (1 Suppl); S 17-31.

  17. Arabska-Przedpełska B, Pawlicka H: Endodoncja-morfologia, diagnostyka, leczenie. Med Tour Press International Wydawnictwo Medyczne Warszawa 2004, Roz.13 Diagnostyka endodontyczna s.169-198.

  18. Krasner P, Verlander P: Stem cells in dentistry and medicine: the dentist’s role. Dent Today.2011 Jan. 30 (1): 128, 130-4.

  19. Liu H, Cao T: Dental application potential of mesenchymal stromal cells and embryonic stem cells. Chin J Dent Res. 2010; 13(2):95-103.

  20. Przybył J, Partka M, Matthews-Brzozowska T, Miśkowiak B: Obraz histologiczny miazgi zębów usuniętych z przyczyn ortodontycznych na podstawie wstępnych badań własnych i dnych z piśmiennictwa. Magazyn Stomatologiczny 4/2007, s.80-83.

  21. Anderson LM, Dumsha TC, Mc Donald MJ, Spitznagel JKJr: Evaluating Il-2 levels in human pulp tissue. J Endod. 2002 Sep; 28 (9): 651-5.

  22. Bartuzi Z, Żbikowska-Gotz M: Rola pierwszej cząsteczki adhezyjnej śródbłonka naczyniowego ( VCAM-1) u chorych z przewlekłymi zapaleniami żołądka i alergią pokarmową. Przegląd Gastroenterologiczny 5/2007, s.256-262.

  23. Bruno KF, Silva JA, Silva TA, Batista AC, Alencar AH, Estrela C: Characterization of inflammatory cell infiltrate in human dental pulpitis. Int. Endod. J 2010 Nov; 43 (11): 1013-21.


20111010C_ Machowska A. Analiza ekspresji genów.
Tabela 1 Wartości współczynników korelacji liniowej Pearsona pomiędzy IL1A RQ i IL2 RQ, IL1A RQ i VCAM RQ oraz IL2 RQ i VCAM RQ w grupach Z, P i Razem oraz wartości testu t-Studenta sprawdzającego istotność tych współczynników


Grupa

Korelacje dla RQ

r

r2

t

p

Z

IL1A i IL2

0,7315

0,5351

1,07

0,4776 > 0,05

IL1A i VCAM

0,0254

0,0006

0,04

0,9746 > 0,05

IL2 I VCAM

-0,4652

0,2164

-1,29

0,2454 > 0,05

P

IL1A i IL2

0,9042

0,8176

4,73

0,0052 < 0,05

IL1A i VCAM

0,6058

0,3669

1,70

0,1494 > 0,05

IL2 I VCAM

0,5315

0,2825

1,88

0,0924 > 0,05

Razem

IL1A i IL2

0,3877

0,1503

1,19

0,2683 > 0,05

IL1A i VCAM

0,2674

0,0715

0,83

0,4267 > 0,05

IL2 i VCAM

0,5638

0,3179

2,81

0,0119 < 0,05

Korelacja pomiędzy IL1A RQ a IL2 RQ w grupie P jest istotna (p < 0,05) i jest prawie pełna (r = 0,9042). 81,76% (r2) zmienności zmiennej IL2A RQ zostało wyjaśnione zmiennością zmiennej IL1A RQ.



Table 1 The Pearson’s line correlation factor between IL1A RQ and IL2 RQ, IL1A RQ and VCAM RQ, IL2 RQ and VCAM RQ in groups Z, P and Total and value of t-Student test


Group

Correlation for RQ

r

r2

t

p

Z

IL1A i IL2

0,7315

0,5351

1,07

0,4776 > 0,05

IL1A i VCAM

0,0254

0,0006

0,04

0,9746 > 0,05

IL2 I VCAM

-0,4652

0,2164

-1,29

0,2454 > 0,05

P

IL1A i IL2

0,9042

0,8176

4,73

0,0052 < 0,05

IL1A i VCAM

0,6058

0,3669

1,70

0,1494 > 0,05

IL2 I VCAM

0,5315

0,2825

1,88

0,0924 > 0,05

Total

IL1A i IL2

0,3877

0,1503

1,19

0,2683 > 0,05

IL1A i VCAM

0,2674

0,0715

0,83

0,4267 > 0,05

IL2 i VCAM

0,5638

0,3179

2,81

0,0119 < 0,05



The determined relative expression of the investigated genes did not show statistically significant differences. It is maintained at similar level in both groups. An interesting issue was the correlation between relative expression (RQ) of Il-1 alpha and Il-2 in the study group – it was significant and nearly complete. It signifies that activation processes of Il-1alpha and Il-2 are mutually related.


©snauka.pl 2016
wyślij wiadomość