Strona główna

Cykliczne analogi enkefaliny zawierające element alkilomocznikowy”


Pobieranie 13.08 Kb.
Data19.06.2016
Rozmiar13.08 Kb.
mgr Małgorzata Ciszewska Warszawa, 29.05.2008

Wydział Chemii UW

Pracownia Peptydów

Autoreferat rozprawy doktorskiej

Cykliczne analogi enkefaliny zawierające element alkilomocznikowy”

Promotor: prof. dr hab. Jan Izdebski


Najstarszym znanym ludzkości środkiem uśmierzającym ból jest opium czyli wydzielina pozyskiwana z maku (Papaver somniferum). Jest to mieszanina kilkunastu alkaloidów, z których najsilniejsze właściwości przeciwbólowe posiada morfina. Od momentu opracowania jej pełnej syntezy (1952 rok), otrzymano ogromną ilość jej pochodnych. Poszukiwania te miały na celu znalezienie substancji posiadającej korzystniejsze właściwości, morfina bowiem oprócz pożądanego efektu analgetycznego daje wiele efektów ubocznych. Badania te znacznie przyczyniły się do rozwoju wiedzy na temat mechanizmu działania środków przeciwbólowych. Wysunięto postulat o istnieniu specyficznych receptorów, przez które morfina oraz inne alkaloidy opium działają na organizm. Teoria ta potwierdziła się w 1971 roku, kiedy to w homogenatach mózgowych odkryto receptory zwane później opioidowymi. W cztery lata później odkryto pierwsze endogenne ligandy dla tych receptorów: enkefalinę leucynową oraz metioninową. Według obecnego stanu wiedzy istnieją trzy podstawowe typy receptorów opioidowych: µ, δ i κ, przy czym każdy z nich posiada inny profil farmakologiczny. Powodem występowania ubocznych efektów działania opioidów zarówno alkaloidowych jak i peptydowych, jest brak selektywności. Peptydy opioidowe jako substancje o bardzo obiecujących właściwościach są przedmiotem wnikliwych badań wielu ośrodków naukowych. Oprócz braku selektywności wobec receptorów opioidowych, posiadają także inne wady, mianowicie ulegają szybkiej degradacji enzymatycznej oraz charakteryzują się ograniczoną biodostępnością. W celu otrzymania peptydów o korzystniejszych właściwościach zarówno chemicznych jak i farmakologicznych, modyfikuje się ich strukturę w różnoraki sposób. Zabiegi takie jak wprowadzanie do cząsteczki aminokwasów nienaturalnych bądź elementów innych niż aminokwasowe pozwalają otrzymać związki o zwiększonej odporności na działanie enzymów proteolitycznych. Usztywnianie łańcuchów peptydowych poprzez wprowadzanie reszt ograniczających rotację bądź poprzez cyklizację nie tylko uodparnia cząsteczkę na hydrolizę lecz także w wielu przypadkach powoduje jej większą selektywność.

Celem niniejszej pracy była synteza dwóch serii cyklicznych analogów enkefaliny zawierających na C-końcu fragment etylomocznikowy. Została również zaproponowana nowa procedura syntezy w fazie stałej. Podczas wcześniejszych badań nad peptydami zawierającymi ugrupowania mocznikowe prowadzonych w Pracowni Peptydów zauważono, iż kwas trifluorooctowy stosowany standardowo do usuwania grupy zabezpieczającej Boc powoduje odszczepienie peptydu, gdy układ mocznikowy znajduje się bezpośrednio przy żywicy MBHA (żywica 4-metylobenzhydryloaminowa) bądź BHA (żywica benzhydryloaminowa). Natomiast użycie do deprotekcji HCl w dioksanie pozwala na syntezę czteropeptydu z dobrą wydajnością. Zadaniem moim było sprawdzenie na ile taka procedura jest przydatna do otrzymywania dłuższych peptydów.



Pierwsza zaprojektowana przeze mnie seria obejmowała 8 cyklicznych analogów (Rys.1) składających się z 5 reszt aminokwasowych, z czego w pozycji 2 i 5 znajdowały się aminokwasy zasadowe, takie jak: Lys, D-Lys, Orn, D-Orn, Dab, Dap. Grupy aminowe w łańcuchach bocznych aminokwasów zasadowych planowałam spiąć mostkiem karbonylowym używając do tego celu węglanu bis(4-nitrofenylowego). Dodatkowo związki te były wydłużone na C-końcu o fragment etylomocznikowy.
{[H-Tyr-D-Daa(&1)-Gly-Phe-Daa(&2)-NHCH2CH2NHCONH2][&1CO&2]}

Rys.1. Amid etylomocznikowy cyklicznej enkefaliny
Druga zaplanowana przeze mnie seria obejmowała 7 cyklicznych analogów enkefaliny składających się z 8 reszt aminokwasowych zakończonych podobnie jak pierwsza seria amidem etylomocznikowym (Rys.2). W tej serii sekwencja cyklicznej enkefaliny połączona miała być z częścią adresową pochodzącą z deltorfiny (Val-Val-Gly).
{[H-Tyr-D-Daa(&1)-Gly-Phe-Daa(&2)-Val-Val-Gly- NHCH2CH2NHCONH2][&1CO&2]}

Rys.2. Amid etylomocznikowy cyklicznej enkefaliny przedłużonej o fragment deltorfinowy
Synteza wszystkich peptydów prowadziłam w fazie stałej na żywicy MBHA. Do sprzęgania używałam zwykle DIC (N,N’-diizopropylokarbodiimidu), a w nielicznych przypadkach wykorzystałam metodę aktywnych estrów i metodę symetrycznych bezwodników. Pierwszym etapem każdej syntezy było przyłączenie do żywicy karbaminianu 4-nitrofenylowego Boc-etylenodiaminy, co dawało w rezultacie etylomocznikowy łącznik pomiędzy żywicą a dalszą częścią peptydu. Następnie przyłączałam kolejne pochodne aminokwasowe chronione grupą Boc. Deprotekcję grupy aminowej prowadziłam przy użyciu chlorowodoru w dioksanie (12-18%). Aminokwasy zasadowe w pozycji 2 i 5 chronione były w łańcuchach bocznych grupami Fmoc. Po przyłączeniu ostatniego aminokwasu usunęłam te grupy roztworem piperydyny w DMF. Liniowe peptydy przyłączone do żywicy poddawałam następnie cyklizacji przy użyciu węglanu bis(4-nitrofenylowego). Reakcje prowadziłam w DMF w różnych rozcieńczeniach, stosując różne czasy reakcji. Cykliczne peptydy odszczepiałam od żywicy 55% roztworem kwasu trifluorooctowego w DCM. Jednocześnie odblokowaniu ulegała N-końcowa grupa aminowa zabezpieczona grupa Boc. Surowe peptydy liofilizowałam z kwasu octowego a następnie poddawałam analizie i oczyszczaniu metodą HPLC. Czystość otrzymanych związków potwierdziłam spektrometrią mas oraz dwuwymiarowym rezonansem magnetycznym.

Stosując nową procedurę syntezy otrzymałam 15 cyklicznych analogów enkefaliny, oraz 2 liniowe (zsyntetyzowane jako układy odniesienia do badań biologicznych). Zastosowana przeze mnie metoda polegająca na budowaniu łańcucha peptydowego na powszechnie stosowanej żywicy MBHA z zastosowaniem pochodnych t-butoksykarbonylowych i HCl w dioksanie do usuwania grup ochronnych, rozszerza stosowalność taktyki wykorzystującej te grupy na syntezy peptydów zawierających na C-końcu ugrupowanie alkilomocznikowe. Możliwość odszczepienia otrzymanych peptydów od żywicy za pomocą kwasu trifluorooctowego pozwala na zrezygnowanie z użycia ciekłego fluorowodoru w finalnym etapie syntezy. Metoda ta, obejmująca również cyklizację peptydu na żywicy okazała się sprawna i użyteczna. Wszystkie otrzymane przeze mnie związki zostały poddane badaniom biologicznym, mającym ustalić ich aktywność opioidową. Wykonano testy tkankowe GPI i MVD, które są reprezentatywne dla receptorów opioidowych odpowiednio μ i δ. Wszystkie analogi okazały się związkami wysoce aktywnymi. Dodatkowo w serii pięciopeptydów da się zauważyć zależność między aktywnością a rozmiarem pierścienia, tzn. najwyższą aktywność w teście GPI i MVD wykazuje związek o rozmiarze pierścienia 18. Zmniejszenie bądź zwiększenie pierścienia powoduje spadek aktywności. Z wyników otrzymanych dla ośmiopeptydów można sądzić, iż wprowadzenie części pochodzącej od deltorfiny (Val-Val-Gly) zmniejsza efekty związane z rozmiarem pierścienia. Dodatkowo można zauważyć, że wprowadzenie elementu etylomocznikowego na C-końcu nie powoduje drastycznych zmian aktywności w stosunku do niepodstawionych amidów enkefalin, co wskazuje na możliwość zastosowania tego rodzaju modyfikacji w syntezie innych, aktywnych biologicznie peptydów.


©snauka.pl 2016
wyślij wiadomość