Strona główna

Na podstawie struktur pojedynczych receptorów i ich kompleksów można wnioskować


Pobieranie 11.97 Kb.
Data17.06.2016
Rozmiar11.97 Kb.
Autoreferat
Receptory wiążące białko G (GPCR – G protein-coupled receptors) są białkami bardzo istotnymi w prawidłowym funkcjonowaniu organizmu ponieważ pośredniczą
w przekazywaniu różnorodnych sygnałów (fizycznych i chemicznych) poprzez błonę komórkową do wnętrza komórek. Z tego powodu są częstym celem molekularnym dla stosowanych leków. Receptory te są białkami błonowymi i dlatego też badanie ich struktury metodami doświadczalnymi jest bardzo utrudnione. Do tej pory znana jest struktura tylko jednego receptora GPCR, jakim jest rodopsyna. Pomimo ogromnej liczby badań nad tymi białkami, mechanizm ich działania na poziomie pojedynczych aminokwasów wciąż nie jest znany. Na szczęście wszystkie receptory wiążące białko G (w szczególności należące do rodziny A – podobnych do rodopsyny) mają podobną budowę i mechanizm działania, dlatego
na podstawie struktur pojedynczych receptorów i ich kompleksów można wnioskować
o budowie i działaniu innych receptorów GPCR.

Rozprawa przedstawia wyniki moich badań nad procesami inaktywacji receptorów GPCR. Inaktywacja receptorów jest integralną częścią ich działania – inaczej receptor byłby ciągle aktywny i dezorganizował pracę komórki prowadząc do stanu patologicznego. Na przykład ciągła aktywność rodopsyny (głównie wskutek mutacji) prowadzi do upośledzenia procesu widzenia. Proces inaktywacji składa się z dwóch etapów: ufosforylowania aktywnego receptora przez odpowiednią kinazę, a następnie związania go przez arestynę, która blokuje receptor zatrzymując jego aktywność sygnałową.

Celem pracy było przedstawienie teoretycznych struktur kompleksów rodopsyny
z kinazą i arestyną oraz wyjaśnienie roli oligomeryzacji receptorów GPCR w procesach inaktywacji. Kolejnym celem było sprawdzenie możliwości przeniesienia mechanizmu znalezionego dla rodopsyny na inaktywację receptorów opioidowych.

Do badań wykorzystałam metodę modelowania przez homologię, Dynamikę Molekularną, Model Anizotropowej Sieci Elastycznej (ANM) oraz Sterowaną Dynamikę Molekularną (SMD). Pierwsza z metod posłużyła uzyskaniu struktur kinazy rodopsynowej oraz arestyny 3, jak również brakujących fragmentów struktur krystalograficznych arestyny 1 i 2. Model ANM został użyty do zbadania ruchów domen kinazy rodopsynowej oraz arestyny, dynamika SMD do zbadania ruchu zginającego arestyny, który to ruch prawdopodobnie zachodzi w czasie wiązania się tego białka do receptora, wreszcie Dynamika Molekularna służyła sprawdzeniu stabilności proponowanych modeli kompleksów białkowych. Modelowanie przez homologię zostało wykonane w programie Modeller a dynamika molekularna oraz SMD za pomocą programu NAMD2 z polem siłowym Charmm27.

Pierwszym etapem pracy było sprawdzenie stabilności zaproponowanego w literaturze modelu oligomeru rodopsyny (Protein Data Bank, model 1N3M). Białko zostało umieszczone w błonie lipidowej o składzie charakterystycznym dla komórek pręcikowych oraz wodzie
z przeciwjonami a następnie poddane dynamice molekularnej w warunkach periodycznych. Układ uległ relaksacji w podanych warunkach i pozostał stabilny. Wyniki tych obliczeń zostały użyte do dalszych etapów badań.

W przypadku kompleksu rodopsyny z kinazą zbudowałam dwa różne modele spełniające teoretyczne wymagania co do bliskości poszczególnych domen tych białek,


w szczególności domeny kinazowej kinazy i fosforylowanego C-końca rodopsyny.
W toku dalszej analizy wyeliminowałam jeden z nich, ponieważ nie był zgodny
z danymi eksperymentalnymi. Poprzez wyznaczenie właściwego modelu uzyskałam także wgląd w mechanizm działania kinazy na rodopsynę. Kompleks angażuje dużą część powierzchni kinazy i tetrameru rodopsyny w wiązanie obu białek. Takie oddziaływanie sprzyja utrzymaniu kinazy blisko rodopsyny i ułatwia fosforylację sąsiednich aktywnych rodopsyn. Skierowany w górę C-koniec aktywnej rodopsyny może dopasować się do miejsca aktywnego kinazy. Stwierdzone metodą ANM ruchy domeny RH i kinazowej sprzyjają lepszemu dopasowaniu powierzchni kinazy do oligomeru rodopsyny.

Z kolei przy badaniu kompleksu rodopsyna-arestyna pomimo istnienia bardzo wielu danych doświadczalnych na temat miejsc oddziaływania arestyny i rodopsyny, istnieje podstawowa niepewność co do stechiometrii tego kompleksu. Systematyczna analiza modeli kompleksów o stechiometrii 1:1 i 2:1 oraz porównanie z wynikami eksperymentów pozwoliło mi wskazać kompleks arestyny z dimerem rodopsyny jako najbardziej prawdopodobny. Dodatkowo, podczas wiązania receptora, arestyna zmienia swoją konformację. Postulowano, że może to być zgięcie białka polegające na obrocie dwóch domen arestyny wokół wspólnej osi. Strukturę takiej aktywnej arestyny uzyskałam przez obrót sztywnych domen, a następnie zadokowałam ją do dimeru ufosforylowanej rodopsyny. Zaproponowany przeze mnie model był zgodny z opublikowanymi wynikami eksperymentalnymi, w szczególności potwierdzał konieczność destabilizacji przez grupy fosforanowe ufosforylowanej rodopsyny rdzenia polarnego i tzw. oddziaływania 3-elementowego w arestynie oraz odsunięcia się C-końca arestyny. Stwierdziłam, że w dimerze tylko jedna rodopsyna musi być aktywna i że stan ten jest rozpoznawany przez domenę C-końca arestyny, druga z rodopsyn musi być ufosforylowana a stan ten jest rozpoznawany z kolei przez domenę N-końca arestyny.

Wyznaczenie drgań normalnych arestyny pokazało, że poza postulowanym dotąd zgięciem arestyny, dostępne są dwa inne ruchy obu jej domen. Przeprowadzenie symulacji zgięcia białka metodą SMD ujawniło dużą plastyczność każdej z domen, które dzięki układowi długich β-kartek mogą się zawijać pozwalając arestynie zgiąć się bardziej niż można to było przewidzieć przez ruch sztywnych domen. Potwierdziły się też obserwacje doświadczalne, że mutacja destabilizująca rdzeń polarny ułatwia zmianę konformacji arestyny a skrócenie jednej z pętli zmianę tę utrudnia. Wreszcie symulacja zgięcia arestyny
w kontakcie z rodopsyną i błoną pokazała, że arestyna nie może osiągnąć swojego maksymalnego zgięcia, ponieważ wcześniej zaczyna oddziaływać z błoną komórkową.
W związku z tym należy przypuszczać, że zmiana konformacji arestyny jest bardziej złożona, a być może jest związana również z innymi drganiami normalnymi lub ruchem jedynej helisy arestyny.

Model oddziaływania arestyny z receptorami opioidowymi został zbudowany przez analogię do kompleksu z rodopsyną. Użyłam heterodimeru receptorów kappa i delta, którego istnienie potwierdzono eksperymentalnie. Zaproponowany model pokazał, że mechanizm wiązania się z arestyną znaleziony dla rodopsyny może zostać przeniesiony na inne receptory GPCR. W tym wypadku również jeden z elementów dimeru musi być aktywny, natomiast drugi ufosforylowany – jako minimalne wymagania dla utworzenia takiego kompleksu. Ufosforylowane seryny i treoniny receptora opioidowego destabilizują rdzeń polarny arestyny, co stanowi impuls do zmiany jej konformacji. Domena C-końca arestyny rozpoznaje stan aktywny receptora, w moim modelu jest to receptor kappa.



Ostatnim etapem jest internalizacja receptora, czyli usunięcie go z błony komórkowej
do pęcherzyków endoplazmatycznych, skąd może wrócić do błony, ale też może być pocięty
na kawałki w proteasomie. Kompleksy białkowe odpowiedzialne za usunięcie receptora
z błony zawierają arestynę oraz związaną z nią klatrynę (białko strukturalne niezbędne
do utworzenia pęcherzyka) i inne białka sygnałowe. Tak więc uzyskane kompleksy receptorów GPCR z arestyną mogą pomóc także w wyjaśnieniu mechanizmów internalizacji oraz roli oligomeryzacji receptorów GPCR w tych procesach. Niedawno odkryte możliwości sygnalizacji receptorów GPCR bez pośrednictwa białka G, natomiast poprzez arestynę, stwarzają zupełnie nowe możliwości wpływania na te procesy poprzez oddziaływanie
na kompleks receptor-arestyna.


©snauka.pl 2016
wyślij wiadomość