Strona główna

Ocena osoczowego stężenia homocysteiny metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (hplc)


Pobieranie 10.12 Kb.
Data18.06.2016
Rozmiar10.12 Kb.
Ocena osoczowego stężenia homocysteiny metodą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC)
Homocysteina występuje w osoczu w postaci związanej z białkami lub tzw. wolnej. Ok. 70% całkowitego osoczowego stężenia aminokwasu przypada na postać związaną z albuminą. Tzw. wolna postać homocysteiny obejmuje głównie homocystynę (disiarczek homocysteiny) lub disiarczki mieszane (np. z cysteiną). Liczne badania wykazały, iż całkowite osoczowe stężenie homocysteiny, stanowiące sumę stężenia postaci związanej z białkami jak i wolnej, jest znamiennie zwiększone w przypadku osób z chorobami naczyń obwodowych, mózgowych lub wieńcowych.
Zasada testu

W pierwszym etapie testu pochodne homocysteiny, obecne w próbce osocza, są poddane redukcji, a uwolniony aminokwas - sprzęgnięciu z fluoroforem. Pozostałe związki, występujące w osoczu, w tym białka, zostają następnie wytrącone i oddzielone przez wirowanie. Próbka supernatantu jest następnie poddana rozdziałowi chromatograficznemu na kolumnie tzw. odwróconej fazy C18 i podlega detekcji fluorescencyjnej. Oszacowanie całkowitego osoczowego stężenia homocysteiny w badanej próbce jest wyznaczane z użyciem odpowiedniego kalibratora oraz wewnętrznego standardu, dodawanego do próbki i kalibratora. Metoda HPLC zapewnia szybką i precyzyjną ocenę osoczowego stężenia homocysteiny przy użyciu tylko jednostopniowej kalibracji.


Przygotowanie odczynników

Rozpuścić kalibrator (CAL) w 1 ml rozpuszczalnika (RECSOL). Uzyskany roztwór przechowywać w temp. -20oC.

Rozpuścić kontrolę (CTRL 1 i 2) w 0.25ml rozpuszczalnika (RECSOL).

Rozpuścić wewnętrzny standard (INT STD) w 12 ml rozpuszczalnika (RECSOL). Uzyskany roztwór przechowywać w temp. -20oC.

Rozpuścić odczynnik redukujący (REDSOL) w 2.4 ml rozpuszczalnika (RECSOL). Uzyskany roztwór przechowywać w temp. 2-8oC do trzech miesięcy.
Przygotowanie próbki

Optymalnym materiałem jest osocze, zbierane na EDTA. Próbka krwi, pobrana na wspomniany antykoagulant, powinna być przechowywana w temp. 2-8oC i odwirowana przed upływem 30 min. (2000g, 10 min., temp. 2-8oC). Uzyskane osocze może być przechowywane do ok. 1 tygodnia, w temp. 2-8oC. Do dłuższego przechowywania zalecana jest temp. -20oC.


Wykonanie oznaczenia

50 l próbki, roztworu kalibratora lub kontroli połączyć z 50 l wewnętrznego standardu, 20 l odczynnika redukującego (REDSOL) oraz 100 l odczynnika sprzęgającego (DER). Tak uzyskane roztwory inkubować przez 10 min. w temp. 60 oC. Przerwać reakcję redukcji pochodnych homocysteiny i sprzęgania wolnego aminokwasu z fluoroforem przez umieszczenie probówek w łaźni lodowej. Następnie, do każdej próbki dodać po 100 l roztworu precypitującego (PREC) i, po dokładnym wymieszaniu, inkubować próbki przez 10 min. w temp. 2-8oC . Po odwirowaniu uformowanego osadu (10 000g, 10 min), z uzyskanego nadsączu pobrać 20 l porcję i poddać ją rozdziałowi chromatograficznemu. Rozdział prowadzić przy przepływie cieczy przez kolumnę, wynoszącym od 0.7 do 1.0 ml/min. Do wzbudzenia fluorescencji próbek używać światła o długości 385 nm, zaś do detekcji fluorescencji – światła o długości 515 nm. Wyznaczyć stężenie homocysteiny w próbce, korzystając z poniższego wzoru:




Wysokość piku homocysteiny w próbce × stężenie kalibratora

Wysokość piku wewnętrznego standardu w próbce

× F = Stężenie homocysteiny w

próbce


F =

Wysokość piku wewnętrznego standardu w kalibratorze

Wysokość piku kalibratora

Interpretacja wyników



< 15 mol/l prawidłowe wartości całkowitego osoczowego stężenia homocysteiny

15 – 30 mol/l wartości wskazujące na niedobory wit. B12 i/lub kwasu foliowego

31 – 100 mol/l wartości występujące u heterozygot dla genów związanych z

homocysteinemią



> 100 mol/l wartości występujące u osób z homocysteinemią


©snauka.pl 2016
wyślij wiadomość