Strona główna

Raport okresowy za IV kwartał 01 – 15. 04. 2015) z realizacji projektu pt. „Wykorzystanie narzędzi molekularnych I proteomicznych do poszukiwania genów I enzymów o potencjale biotechnologicznym”


Pobieranie 272.98 Kb.
Strona1/5
Data19.06.2016
Rozmiar272.98 Kb.
  1   2   3   4   5



Raport okresowy za IV kwartał (1.01 – 15.04.2015) z realizacji projektu pt. „Wykorzystanie narzędzi molekularnych i proteomicznych do poszukiwania genów i enzymów o potencjale biotechnologicznym”

Spis treści


Spis treści 1

Etap I. Wyprowadzenie i utrzymanie kultur in vitro materiałów badawczych 3

I. 4. Podawanie elicytorów (opracowanie metodyki) 3

Etap II. Analizy chemiczne metabolitów 4

II. 6. Dobieranie stężeń elicytorów i określanie optymalnego czasu działania 4

Ciemiężyca czarna. 4

Kozieradka pospolita. 4

Etap III Analizy proteomiczne 9

III.2. Ekstrakcja białek 9

III.6. Selekcja białek istotnych dla analizowanego procesu 12

III.7. Identyfikacja białek na spektrometrze mas 16

Etap IV. Analiza profilu ekspresji 18

IV.4. Analiza różnicowa profili ekspresyjnych 18

Kozieradka pospolita Trigonella foenum-graecum 18

Etap V. Klonowanie wybranych genów 24

V.5. Przygotowanie materiału do klonowania 24

Synteza pierwszej nici cDNA (ProtoScript II First Strand cDNA Synthesis Kit) 24

Oczyszczanie dwuniciowego cDNA 26

Trawienie restrykcyjne DNA testowanego i eliminującego 26

Ligacja R-adaptorów do fragmentów restrykcyjnych DNA 26

Amplifikacja DNA testowanego i eliminującego w reakcji PCR 27

Oczyszczanie amplikonów DNA testowanego i eliminującego 27

Usuwanie R-adaptorów z amplikonów DNA testowanego i eliminującego 28

Ligacja J-adaptorów do amplikonów DNA testowanego 29

Wstępna amplifikacja produktów różnicowych J-DPI metodą PCR 30

Trawienie jednoniciowego DNA nukleazą Mung Bean 31

Amplifikacja produktów różnicowych J-DPI metodą PCR 32

Druga runda hybrydyzacji 32

Usuwanie J-adaptorów z produktów różnicowych J-DPI 33

Ligacja N-adaptorów do produktów różnicowych DPI 34

Trzecia runda hybrydyzacji 37

Usuwanie N-adaptorów z produktów różnicowych DPII 38

Ligacja J-adaptorów do produktów różnicowych DPII 38

V.6. Klonowanie wyselekcjonowanych genów 42

Sekwencjonowanie sklonowanych fragmentów DNA 52




Etap I. Wyprowadzenie i utrzymanie kultur in vitro materiałów badawczych

I. 4. Podawanie elicytorów (opracowanie metodyki)


W pierwszym etapie prac zainicjowano hodowle roślin w kulturach in vitro. Kolejnym etapem była indukcja metabolitów wtórnych u roślin z rodzaju Veratrum i Trigonella. Aby zidentyfikować geny, które biorą udział w biosyntezie tych metabolitów, należy je najpierw zaindukować do zwiększonej produkcji tych związków. W tym celu rośliny traktowano elicytorami i prekursorami. Elicytory są to związki, które stymulują odpowiedź obronną roślin. Ponieważ szlaki wtórnego metabolizmu są aktywowane przez czynniki stresowe, elicytory mogą być stosowane do zwiększenia syntezy tych metabolitów w roślinnych kulturach in vitro.

Substancjami tymi były kwas salicylowy w stężeniu 0,1 mM oraz 2 mM jak również jasmonian metylu 100 µL/L. Jako prekursory czyli substraty, którą bezpośredni udział w biosyntezie docelowych związków wybrano cholesterol w stężeniu 100 mg/L oraz skwalen 100 µL/L. Ze względu na znikomą rozpuszczalność tych substancji w wodzie, wszystkie te związki były przygotowane 10% roztworze etanolu. Rośliny spryskiwano roztworem odpowiedniego związku, a następnie zbierano po 1, 3, 6 i 9 dniach. Zbiór roślin odbywał się poprzez zamrożenie i utarcie materiału roślinnego w ciekłym azocie.

Kultury in vitro zostały wyprowadzone, aby zminimalizować wpływ innych czynników zewnętrznych, więc zaindukowanie biosyntezy powinno być związane z działaniem konkretnego elicytora lub prekursora.

Kultury Veratrum nigrum zostały wybrane jako cenne źródło aktywnych alkaloidów steroidowych, związków o dużym potencjale farmakologicznym, których głównym reprezentantem jest jerwina. Natomiast kozieradka zawiera przede wszystkim saponiny steroidowe, w szczególności diosgeninę.

Materiał zebrany po indukcji roślin zabezpieczono do dalszych analiz metabolitów, białek oraz RNA.

Etap II. Analizy chemiczne metabolitów




II. 6. Dobieranie stężeń elicytorów i określanie optymalnego czasu działania


Materiał badawczy uzyskany po indukcji w pierwszym etapie badań poddano procesowi ekstrakcji i identyfikacji metabolitów.

Wszystkie dane uzyskane z indukcji roślin elicytorami i prekursorami poddano wieloczynnikowej analizie wariancji.


Ciemiężyca czarna.


Największą ilość jerwiny zaobserwowano w pierwszym i trzecim dniu po traktowaniu skwalenem, po czym w dniu szóstym i dziewiątym uległa ona obniżeniu. Maksymalne stężenie badanego metabolitu w świeżej masie (582,97 ng/g) oznaczono w próbkach pobranych w trzeci dzień. Stanowi to wartość niemal 2,7-razy wyższą niż w próbie kontrolnej.

Poziom jerwiny w roślinach indukowanych roztworem cholesterolu wzrastał stopniowo w kolejnych dniach doświadczenia (od około 100 ng/g w pierwszym dniu do 364 ng/g w dniu ostatnim). W próbkach spryskanych jasmonianem metylu, całkowity poziom oznaczanego metabolitu był niższy w porównaniu z próbką kontrolą. Traktowanie kwasem salicylowym (zarówno w stężeniu 0,1 mM oraz 2 mM) nie wywołało znaczących różnic w poziomie jerwiny.

Na podstawie otrzymanych wyników możemy stwierdzić, że spośród czterech badanych czynników, cholesterol i skwalen najlepiej intensyfikują produkcję jerwiny u roślin V. nigrum rosnących w warunkach in vitro. Zastosowane elicytory – kwas salicylowy i jasmonian metylu w badanych stężeniach okazały się nieskuteczne. Obiecujące wyniki dla obu prekursorów mogą potwierdzać ich obecność w szlaku biosyntezy alkaloidów steroidowych.

Kozieradka pospolita.


Procedurę izolacji diosgeniny wybrano na podstawie badań z poprzedniego kwartału. Metoda ta obejmowała hydrolizę materiału roślinnego (Fot. 5a) z 1 M kwasem siarkowym (VI) w 70% izopropanolu a następnie trzykrotną ekstrakcję heksanem (Fot. 5b) oraz płukanie 1 M wodorotlenkiem sodu i wodą destylowaną.

a b

Fot. 1a Hydroliza materiału roślinnego prowadzona w kolbach okrągłodennych podłączonych do chłodnic zwrotnych kulowych i ogrzewanych czaszami grzejnymi b) Rozdział składników pomiędzy dwie fazy wodną (dolna) oraz organiczną (górna-heksan) podczas ekstrakcji w rozdzielaczu stożkowym

Wyniki zawartości diosgeniny w ekstraktach roślinnych uzyskanych po indukcji roślin przedstawiają się następująco.

Zawartość diosgeniny w kontroli utrzymywała się na mniej więcej stałym poziomie i nie przekroczyła 100 ug/g świeżej masy.

Jeśli chodzi o działanie elicytorów to kwas salicylowy nie wywołał istotnych różnic w poziomie diosgeniny i nie był już analizowany w dalszych etapach. Natomiast jasmonian metylu indukował biosyntezę diosgeniny w pierwszym i trzecim dniu po działaniu elicytorem. W 1 dniu średnie stężenie diosgeniny wynosiło około 211 ug/g śm.

Wpływ obydwu prekursorów był istotny. Cholesterol zwiększał wytwarzanie diosgeniny w 3 i 6 dniu. Natomiast skwalen w 3 dniu i był to dwukrotny wzrost, średnie stężenie diosgeniny wynosiło prawie 243 ug/g śm.

Uzyskane wyniki pozwalają wysnuć również wniosek, że działanie jasmonianem powoduje szybszą reakcję u roślin, ponieważ wzrost poziomu diosgeniny pojawia się w pierwszym i trzecim dniu, natomiast traktowanie prekursorami powoduje indukcję metabolitu głównie w trzecim i szóstym dniu. Badania pozwoliły zweryfikować również rolę cholesterolu jako substratu w biosyntezie diosgeniny. W ramach przeprowadzonych badań zoptymalizowano metody indukcji wytwarzania diosgeniny.


Materiał badawczy uzyskany po indukcji kultur roślinnych i kultur korzeniowych w pierwszym etapie badań poddano procesowi ekstrakcji i identyfikacji metabolitów.

Ekstrakcję aukubiny i katalpolu prowadzono metodą zwaną ‘hot water extraction’, która w literaturze jest opisywana jako najbardziej efektywna technika izolacji badanych glikozydów irydoidowych. Rozdrobniony surowiec roślinny poddano maceracji w wodzie przez 40 min, a następnie uzyskane maceraty ogrzewano przez 60 min pod chłodnicą zwrotną. Uzyskane ekstrakty sączono na lejku Buchnera i liofilizowano. Zastosowanie wody jako rozpuszczalnika było możliwe ze względu na obecność w cząsteczce reszty cukrowej (w przypadku aukubiny i katalpolu jest to glukoza).

Diosgeninę z kultur korzeniowych kozieradki pospolitej ekstrahowano i identyfikowano przy zastosowaniu procedur identycznych jak w przypadku kultur roślinnych.


Rys. 1. Krzywa kalibracyjna dla katalpolu w zakresie stężeń od 5 µg/mL do 100 µg/mL.

W przypadku roślinnych kultur in vitro Plantago lanceolata nie zaobserwowano znaczącego wpływu zastosowanego elicytora (ekstraktu drożdżowego) na zawartość aukubiny (rys. 5) i katalpolu (rys. 6). Stężenie metabolitów nie zmieniało się również istotnie w kolejnych dniach doświadczenia. Maksymalne stężenie aukubiny oznaczono w próbce pobranej w dzień 8 i wynosi ono 3983 µg/g świeżej masy. Zaobserwowano również korelację pomiędzy stężeniem aukubiny i katalpolu w poszczególnych próbkach – niskie stężenie aukubiny odpowiada niskiej zawartości katalpolu w roślinie i odwrotnie, chociaż stężenie obu metabolitów jest na różnym poziomie. Zawartość aukubiny oscyluje na poziomie kilku tysięcy µg na g świeżej masy, z kolei stężenie katalpolu to maksymalnie 52 µg/g śm.




Rys. 2. Zawartość aukubiny u babki lancetowatej po traktowaniu ekstraktem drożdżowym i w próbkach kontrolnych w kolejnych dniach doświadczenia.



Rys. 3. Stężenie katalpolu u babki lancetowatej po traktowaniu ekstraktem drożdżowym i w próbkach kontrolnych w kolejnych dniach doświadczenia.

Kultury in vitro przetacznika kłosowego indukowano czterema czynnikami – ekstraktem drożdżowym (YE), chlorkiem kobaltu (Co), jasmonianem metylu (MJ) oraz kwasem salicylowym (SA) w odpowiednich stężeniach, dobranych na podstawie danych literaturowych. Zmiany zawartości aukubiny pod wpływem działania w/w czynników i w poszczególnych dniach doświadczenia pokazano na rys. 7.




Rys. 4. Stężenie aukubiny u przetacznika kłosowego po traktowaniu elicytorami w kolejnych dniach doświadczenia

W ekstraktach przetacznika zawartość katalpolu było na poziomie szumu, dlatego nie oznaczano go ilościowo. Podobnie jak w przypadku babki lancetowatej, nie zaobserwowano znaczącego wpływu badanych elicytorów na zmianę stężenia interesującego nas metabolitu. W kolejnych dniach doświadczenia zawartość aukubiny utrzymywała się na stałym poziomie. Stężenie aukubiny zarówno u Plantago lanceolata jak i u Veronica spicata jest zbliżone po przeliczeniu na gram świeżej masy (2000-4000 µg/g), więc obie te rośliny w takim samym stopniu mogą być źródłem surowca do produkcji środków leczniczych.


  1   2   3   4   5


©snauka.pl 2016
wyślij wiadomość