Strona główna

Rozdział chromatograficzny mieszaniny hemoglobiny ludzkiej I albuminy wołowej przy zastosowaniu wymieniacza jonowego deae-celulozy


Pobieranie 55.05 Kb.
Data18.06.2016
Rozmiar55.05 Kb.
Rozdział chromatograficzny mieszaniny hemoglobiny ludzkiej i albuminy wołowej przy zastosowaniu wymieniacza jonowego DEAE-celulozy

Odczynniki i badany materiał:


  1. 4% roztwór albuminy wołowej w 0,1 mol/l buforze Tris-HCl o pH=8,3.



  2. Mieszanina hemoglobiny ludzkiej i albuminy wołowej




  1. Wzorcowy, 2,5% roztwór albuminy wołowej (do metody biuretowej)




  1. Wzorcowy roztwór białka (do metody Bradford)




  1. Bufor startowy: 0,1 mol/l bufor Tris-HCl o pH=8,3



  2. 0,3 mol/l roztwór NaCl w roztworze startowym



  3. Podstawowy roztwór odczynnika biuretowego



  4. Odczynnik Bradford

Wykonanie oznaczenia
Rozdział chromatograficzny
1. Kolumnę chromatograficzną (wys. 10-15 cm) wypełnić 10-15 ml zawiesiny DEAE-celulozy, wcześniej namoczonej w 0,1 mol/l buforze Tris-HCl o pH=8,3 (bufor startowy).

2. Przed rozdziałem białek kolumnę przemyć, przelewając przez nią ok. 30-50 ml buforu startowego.

3. Na powierzchnię znajdującego się w kolumnie żelu nanieść 3 ml mieszaniny hemoglobiny ludzkiej i albuminy wołowej.

4. Następnie wolno przelewać przez kolumnę 50 ml buforu startowego zbierając równocześnie wypływające z kolumny frakcje obj. ok. 1,5-2 ml.

5. Po zebraniu 15 frakcji przepłukać kolumnę pozostałą ilością buforu, który może być zbierany do zlewki.

6. Zaadsorbowane na DEAE-celulozie albuminy wyeluować, przelewając przez kolumnę 50 ml 0,3 mol/l roztworem NaCl w buforze startowym, zbierając równocześnie frakcje o obj. 1,5-2 ml.



7. W barwnych frakcjach oznaczyć zawartość hemoglobiny przez pomiar absorbancji przy dł. fali 540 nm, natomiast we frakcjach bezbarwnych oznaczyć stężenie albuminy metodą biuretową i metodą Bradford.
Oznaczanie stężenia albuminy wołowej w zebranych z kolumny bezbarwnych frakcjach

  1. Przygotować co najmniej 17 probówek

  2. Do pierwszej probówki odpipetować wodę (ślepa odczynnikowa Śl)

  3. Do kilku kolejnych probówek (oznakowanych B-Bx) odpipetować 0,5 ml frakcji uzyskanych w trakcie rozdziału chromatograficznego (ilość probówek=ilość zebranych frakcji)

  4. Do dalszych 5 probówek (W1-W5) dodać podane w tabelce objętości wzorcowego roztworu albuminy wołowej.

  5. Zawartość probówek z wzorcowym roztworem albuminy wołowej wypełnić wodą tak, aby łączna objętość wynosiła 0,5 ml.

  6. Do wszystkich probówek dodać odczynnik biuretowy i dokładnie wymieszać

  7. Probówki pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 min dla rozwinięcia barwy

  8. Następnie zmierzyć absorbancję frakcji oraz roztworów wzorcowych wobec ślepej odczynnikowej (Śl) przy dł. fali 540 nm.




Materiał i odczynniki

Oznakowanie probówek i objętość oznakowanych roztworów w ml

Śl

B-Bx

W1

W2

W3

W4

W5

Kolejne frakcje

-

0,5

-

-

-

-

-

Wzorcowy roztwór białka (2,5%)

-

-

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

Woda

0,5

-

0,45

0,40

0,35

0,30

0,25

Odczynnik biuretowy

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Dokładnie wymieszać i odstawić na 30 min w temp. pokojowej

Zmierzyć A540

-



















Obliczyć ilość mg białka w próbce

-





















Metoda Bradford

  1. Przygotować 25 probówek

  2. Do pierwszej probówki odpipetować wodę (ślepa odczynnikowa-Śl)

  3. Do drugiej dodać bufor (ślepa z buforem-ŚlB)

  4. Do kilku kolejnych probówek (B-Bx) odmierzyć 0,1 ml frakcji uzyskanych podczas rozdziału chromatograficznego (ilość probówek odpowiada ilości zebranych frakcji)

  5. Do dalszych ośmiu probówek (W-Wx)dodać podane w tabelce objętości wzorcowego roztworu albuminy wołowej

  6. Zawartość probówek z wzorcowym roztworem albuminy wołowej uzupełnić wodą tak, aby łączna objętość wynosiła 0,1 ml

  7. Do wszystkich probówek dodać odczynnik Bradford i dokładnie wymieszać

  8. Probówki zostawić w temperaturze pokojowej na 5 min dla rozwinięcia barwy

  9. Po upływie tego czasu zmierzyć absorbancję frakcji oraz roztworów wzorcowych wobec ślepej odczynnikowej (Śl) przy długości fali 595 nm.

  10. Jeżeli absorbancja frakcji (B) jest wyższa od absorbancji próbki wzorcowej W8, to należy ją rozcieńczyć wodą i powtórzyć oznaczenie




Materiał i odczynniki

Oznakowanie probówek i objętość dodawanych roztworów w ml

Śl

ŚlB

B-Bx

W1

W2

W3

W4

W5

W6

W7

W8

Bufor

-

0,1

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Frakcje po rozdziale

-

-

0,10

-

-

-

-

-

-

-

-

Wzorcowy roztwór białka (0,02%)

-

-

-

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,08

0,10

Woda

0,1

-

-

0,09

0,08

0,07

0,06

0,05

0,04

0,02

-

Odczynnik Bradford

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

1,0

Dobrze wymieszać i odstawić na 5 min.

Zmierzyć A595

-































Obliczyć ilość µg białka w próbce

-
































©snauka.pl 2016
wyślij wiadomość