Strona główna

Ćwiczenie 13 T: Diagnostyka zaburzeń homeostazy białek (1)


Pobieranie 51.07 Kb.
Data18.06.2016
Rozmiar51.07 Kb.
Ćwiczenie 13

T: Diagnostyka zaburzeń homeostazy białek (1)

Zagadnienia teoretyczne:

Białka osocza i płynów ustrojowych – metody oznaczania



Ćwiczenie praktyczne:

Oznaczanie stężenia białka całkowitego w surowicy krwi metodą biuretową. Oznaczanie stężenia białka w surowicy krwi metodą refraktometryczną. Oznaczanie stężenia albuminy w surowicy krwi metodą kolorymetryczną.



  1. Oznaczanie stężenia białka całkowitego w surowicy krwi metodą biuretową

Zasada oznaczenia:

Wiązania peptydowe białka reagują w środowisku alkalicznym z jonami Cu+2 tworząc barwny kompleks. Intensywność zabarwienia jest wprost proporcjonalna do ilości wiązań peptydowych, a tym samym do stężenia białka.


Aparatura i sprzęt laboratoryjny:

  • spektrofotometr

  • probówki Eppendorf

  • pipety automatyczne o pojemności 1 cm3, 0,1 cm3

Materiał badany i odczynniki:

  • surowica badana

  • surowica kontrolna N lub P

  • wzorzec białka

  • odczynnik roboczy do oznaczania stężenia białka całkowitego (BioMaxima)

Wykonanie:

  • opisać probówki, odmierzyć dokładnie odpowiednie objętości roztworów – jak podano w poniższej tabeli:







Próba

badana


Próba

kontrolna



Próba wzorcowa

Próba

zerowej


Odczynnik roboczy

1000 L

1000 L

1000 L

1000 L

Surowica badana

10 L

-

-

-

Surowica kontrolna

-

10 L

-

-

Wzorzec

-

-

10 L

-

Dokładnie wymieszać. Po 10 minutach odczytać absorbancję próby badanej (AB), kontrolnej (AK) i wzorcowej (AW) (=546 nm) wobec próby zerowej.


Obliczenia:

  • obliczyć stężenie białka całkowitego ze wzoru:

K

stężenie białka całkowitego [g/dL] = ∙ stężenie wzorca

W


  1. Oznaczanie stężenia białka całkowitego w surowicy krwi metodą refraktometryczną

Zasada oznaczenia:

Współczynnik załamania światła n surowicy zmienia się proporcjonalnie do stężenia białka całkowitego.



Aparatura i sprzęt laboratoryjny:

  • refraktometr Abbego

  • pipeta automatyczna o pojemności 0,1 cm3

  • waciki

Materiał badany i odczynniki:

  • surowica badana

  • surowica kontrolna N lub P

  • woda destylowana

Wykonanie:

Zmierzyć współczynnik załamania światła surowicy badanej i kontrolnej (postępować zgodnie z instrukcją obsługi refraktometru Abbego).



Obliczenia:

Wyznaczyć zawartość białka w surowicy badanej i kontrolnej korzystając z tabeli:



Współczynnik załamania surowicy

Zawartość białka [g/dL]

1,337

0,63

1,338

1,21

1,339

1,79

1,340

2,37

1,341

2,95

1,342

3,54

1,343

4,11

1,344

4,68

1,345

5,26

1,346

5,84

1,347

6,42

1,348

7,02

1,349

7,60

1,350

8,17




  1. Oznaczanie stężenia albuminy w surowicy krwi metodą kolorymetryczną

Zasada oznaczenia:

Albumina tworzy z zielenią bromokrezolową (BCG) w środowisku kwaśnym barwny kompleks. Intensywność powstałego zabarwienia mierzona przy 630 nm jest proporcjonalna do stężenia albuminy w próbie.


Aparatura i sprzęt laboratoryjny:

  • spektrofotometr

  • probówki Eppendorf

  • pipety automatyczne o pojemności 1 cm3, 0,02 cm3

Materiał badany i odczynniki:

  • surowica badana

  • surowica kontrolna N lub P

  • wzorzec albuminy

  • odczynnik roboczy do oznaczania stężenia białka całkowitego (BioMaxima)

Wykonanie:

  • opisać probówki, odmierzyć dokładnie odpowiednie objętości roztworów – jak podano w poniższej tabeli:




Próba

badana


Próba

kontrolna



Próba wzorcowa

Próba

zerowej


Odczynnik roboczy

1000 L

1000 L

1000 L

1000 L

Surowica badana

10 L

-

-

-

Surowica kontrolna

-

10 L

-

-

Wzorzec

-

-

10 L

-

H2O destylowana

-

-

-

10 L

Dokładnie wymieszać. Po 2 minutach odczytać absorbancję próby badanej (AB), kontrolnej (AK) i wzorcowej (AW) (=630 nm) wobec próby zerowej.


Obliczenia:

  • obliczyć stężenie białka całkowitego ze wzoru:

K

stężenie albuminy [g/dL] = ∙ stężenie wzorca



W

Wartości stężeń w surowicach kontrolnych

Stężenia w surowicy kontrolnej N

Wartość środkowa

Zakres

Białko całkowite [g/dL]

6,63

5,72 – 7,54

Albumina [g/dL]

4,02

3,65 – 4,39

Stężenia w surowicy kontrolnej P

Wartość środkowa

Zakres

Białko całkowite [g/dL]

4,34

3,61 – 5,07

Albumina [g/dL]

2,70

2,18 – 3,23




©snauka.pl 2016
wyślij wiadomość