Strona główna

Zasada oznaczenia


Pobieranie 100.6 Kb.
Data18.06.2016
Rozmiar100.6 Kb.


OZNACZANIE STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI METODĄ ENZYMATYCZNĄ-OXY


ZASADA OZNACZENIA
Glukoza pod wpływem oksydazy glukozowej utlenia się do kwasu glukonowego z wytworzeniem nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru w obecności peroksydazy ulega rozłożeniu do wody i tlenu, a ten utlenia chromogen (ABTS, sól sodowa kwasu 2,2’-azyno-di-(3-etylo-benzotiazolidyno-6-sulfonowego), czego efektem jest zmiana barwy. Natężenie powstałego zabarwienia jest proporcjonalne do stężenia glukozy w badanej próbce i mierzy się je spektrofotometrycznie. Metoda ta jest specyficzna dla D-glukozy i pozwala na oznaczanie jej stężenia w surowicy, krwi, moczu i płynie mózgowo-rdzeniowym.


WYKONANIE ĆWICZENIA
Materiał badany:

- surowica


Odczynniki:

- bufor fosforanowy, pH 7

- roztwór roboczy enzymów (oksydazy glukozowej i peroksydazy)

- roztwór wzorcowy glukozy I o stężeniu 5 mmol/l

- roztwór wzorcowy glukozy II o stężeniu15 mmol/l

- roztwór odbiałczający (kwas nadchlorowy 0,33 mmol/l)


Przygotowanie próby badanej:

Do próbówki wirówkowej odmierzyć roztwór odbiałczający i materiał badany (surowicę) w stosunku 10:1 (1ml roztworu odbiałczającego: 100µl surowicy). Zawartość próbówki wymieszać. Próbkę ustawić na wadze szalkowej i zrównoważyć umieszczając na drugiej szalce pustą probówkę wirnikową i dopełniając ją wodą destylowaną. Obie probówki umieścić naprzeciwlegle w wirówce. Wirować 15 minut przy 3000 obrotów.


Przygotowanie rozcieńczeń do krzywej wzorcowej:

W oznaczonych próbówkach przygotować roztwory wzorcowe według poniższej tabeli.





Numer próbówki



Stężenie roztworu wzorcowego [mmol/l]


Wzorzec I
[ml]

Wzorzec II
[ml]

Woda destylowana

[ml]

Roztwór odbiałczający


W1

5

0,1

-

0,5

0,5

W2

10

0,2

-

0,4

0,5

W3

15

-

0,1

0,5

0,5

W4

20

0,4

-

0,2

0,5


Wykonanie oznaczenia:

Do czystych i oznaczonych próbówek laboratoryjnych odmierzyć składniki wg tabeli przedstawionej poniżej. Objętości w tabeli zostały podane w ml:







Roztwór wzorcowy

Supernatant z próby badanej

Roztwór odbiałczający

Roztwór roboczy

Próba odczynnikowa

-

-

0,2

1

W1

0,2

-

-

1

W2

0,2

-

-

1

W3

0,2

-

-

1

W4

0,2

-

-

1

Próba badana

-

0,2

-

1

Podane składniki wymieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po tym czasie zmierzyć absorbancję prób wzorcowych i próby badanej względem próby odczynnikowej przy długości fali  = 500 nm. Pomiar powinien być przeprowadzony w czasie przed upływem 50 minut od dodania roztworu roboczego.


Opracowanie wyników:

Na podstawie absorbancję dla prób wzorcowych należy wykreślić na papierze milimetrowym krzywą wzorcową, odznaczając na osi odciętych (X) stężenia roztworów wzorcowych, a na osi rzędnych (Y) odpowiadającą im absorbancję. Stężenie glukozy należy odczytać ze sporządzonej krzywej kalibracyjnej. Zakres prostoliniowości mieści się w granicach od 0 – 20 mmol/l. Określić, czy stężenia w badanej próbce mieściło się w granicach wartości prawidłowych.



OZNACZANIE STĘŻENIA GLUKOZY WE KRWI METODĄ ENZYMATYCZNĄ-HEXO


ZASADA OZNACZENIA
Glukoza pod wpływem heksokinazy ulega fosforylacji przy udziale ATP do glukozo-6-fosforanu i ADP. Glukozo-6fosforan jest utleniany do 6-fosfoglukonianu przy jednoczesnej redukcji NAD do NADH. Powstaniu NADH towarzyszy wzrost absorbancji przy długości fali 340nm, który jest proporcjonalny do stężenia glukozy w badanej próbce. Metoda pozwala na oznaczanie jej stężenia w surowicy krwi, osoczu i moczu.
Gline 4lukoza +ATP G-6-P +ADP
G-6-PDH (Dehydrogenaza G-6-P)

Gline 5-6-P +NAD 6-PG +NADH + H+



WYKONANIE ĆWICZENIA
Materiał badany:

- surowica, osocze, mocz


Odczynniki:

- trójetanoloamina 20 mmol/l

- ATP 1 mmol/l

- NAD 0,69 mmol/l

- heksokinaza > 1,500 U/l

- dehydrogenaza G-6-P > 1,500 U/l

pH 7,3 temp. 20oC
Wykonanie oznaczenia:

Przygotować i oznakować probówki laboratoryjne.

Właściwą ilość odczynnika ogrzać do temperatury reakcji 37oC co najmniej przez 5 minut. Dodać pozostałych składników mieszaniny reakcyjnej (wg tabeli poniżej)




próba ślepa

próba badana

próba wzorcowa

Odczynnik

1 ml

1 ml

1 ml

Surowica lub standard

-

10 l

10 l

Woda destylowana

10 l

-

-

Inkubować 3 minuty w temperaturze 37oC.

Zmierzyć absorbancję próby badanej oraz standardu względem próby ślepej przy długości fali 340 nm. Absorbancja jest stabilna przez 15 minut.


Opracowanie wyników:

Obliczyć wyniki wg następującego wzoru:



NORMY:

Surowica/osocze- 70-105 mg/dl (3,89-5,83 mmol/l)

Mocz- 5-15 mg/dl (0,28-0,83 mmol/l)

Do diagnozowania cukrzycy i lub osłabionej tolerancji glukozy (GT) WHO zaleca następujące kryteria:


Krew żylna -


Cukrzyca na czczo =lub> 140 mg/dl

2 godz. po jedzeniu 200 mg/dl



Krew kapilarna -

Cukrzyca na czczo =lub> 140 mg/dl

2 godz. po jedzeniu 220 mg/dl


Krew żylna -


GT na czczo < 140 mg/dl

2 godz. po jedzeniu 140-200 mg/dl



Krew kapilarna -

GT na czczo < 140 mg/dl

2 godz. po jedzeniu 160-220 mg/dl



Oznaczanie stężenia glukozy w surowicy
metodą o-toluidynową

O-toluidyna (o-metyloanilina) w środowisku bezwodnym w temperaturze 100oC reaguje z furfuralowymi pochodnymi aldoz. W tych warunkach powstaje barwny kompleks o zabarwieniu niebieskim. Natężenie barwy, proporcjonalne do stężenia glukozy, mierzy się kolorymetrycznie. Metodą tą oznacza się także galaktozę


i mannozę. Fruktoza reaguje słabo w tych warunkach. Wpływ fruktozy i pentoz pozostaje wyeliminowany przez dokonanie pomiaru przy długości fali 630 nm. W metodzie tej przeszkadzają także leki zawierające grupę aldehydową. Znacznie zawyżone wyniki uzyskuje się u pacjentów otrzymujących dekstran.
WYKONANIE ĆWICZENIA:

Materiał badany: Surowica



Odczynniki: 1. Odczynnik o-toluidynowy

2. Odczynnik odbiałczajacy – 10% kwas trójchlorooctowy (TCA)

3. Wzorcowe roztwory glukozy o stężeniach: 50, 100, 250, 500 i 1000 mg/dl

Uwaga


Odczynnik o-toluidynowy jest szkodliwy dla zdrowia (kancerogenny i żrący). Należy odmierzyć go dozownikiem strzykawkowym, biuretą lub mikropipetą dozującą (wykonuje prowadzący ćwiczenie). Od momentu dodania odczynnika o-toluidynowego należy zachować szczególną ostrożność, w szczególności unikać wdychania par

  1. Przygotowanie prób wzorcowych.

W sześciu oznaczonych probówkach przygotować próby wzorcowe. Zawartość probówki W1 traktować jako próbę odczynnikową. Odmierzyć składniki według poniższej tabeli (objętości w ml):













Roztwory wzorcowe glukozy

Nr probówki

Woda destylowana

Odczynnik odbiałczający

50 mg/dl

100 mg/dl

250 mg/dl

500 mg/dl

1000 mg/dl

W1

0,6

0,5

-

-

-

-

-

W2

0,5

0,5

0,1

-

-

-

-

W3

0,5

0,5

-

0,1

-

-

-

W4

0,5

0,5

-

-

0,1

-

-

W5

0,5

0,5

-

-

-

0,1

-

W6

0,5

0,5

-

-

-

-

0,1


2. Przygotowanie próby badanej.
Do probówki wirówkowej odmierzyć następujące odczynniki (w ml):


woda destylowana

0,5

odczynnik odbiałczający

0,5

surowica

0,1

Zawartość probówki wymieszać. Próbkę ustawić na wadze szalkowej i zrównoważyć, umieszczając na drugiej szalce pustą probówkę wirówkową i dopełniając ją wodą destylowaną. Obie probówki umieścić naprzeciwlegle w wirówce. Wirować 10 min. przy 2000 obr/min. (wykonuje prowadzący ćwiczenie).




  1. Przygotowanie reakcji z odczynnikiem o-toluidynowym.

Do siedmiu czystych probówek odmierzyć składniki wg tabeli (objętości w ml):













Zawartość probówek z pkt. 1.

Numer probówki

odczynnik o toluidynowy

supernatant z próby badanej

W1

W2

W3

W4

W5

W6

1

1,0

-

0,2

-

-

-

-

-

2

1,0

-

-

0,2

-

-

-

-

3

1,0

-

-

-

0,2

-

-

-

4

1,0

-

-

-

-

0,2

-

-

5

1,0

-

-

-

-

-

0,2

-

6

1,0

-

-

-

-

-

-

0,2

B

1,0

0,2

-

-

-

-

-

-

Wymieszać, probówki przykryć luźno folią aluminiową i wstawić do wrzącej łaźni wodnej dokładnie na 8 minut. Po tym czasie próby ochłodzić w zimnej wodzie. Do każdej próbówki dodać po 1 ml wody destylowanej, delikatnie wymieszać. Zmierzyć absorbancję prób wzorcowych (probówki nr 2-6) i próby badanej (probówka B) względem próby odczynnikowej (probówka nr 1) przy długości fali 630 nm.





  1. Wykonanie krzywej standardowej.


line 3 absorbancja

line 2

50 100 250 500 1000 stężenie glukozy

[mg/dl]
Na podstawie absorbancji dla prób wzorcowych (probówki nr 2-6) wykreślić krzywą standardową i na tej podstawie określić stężenie glukozy w próbie badanej (probówka B).

ZAGADNIENIA DO ĆWICZENIA:
1. Hipoglikemia - definicja, przyczyny.

2. Hiperglikemia - definicja, przyczyny.

3. Cukrzyca: definicja, rodzaje. Leczenie.

3. Hormony regulujące stężenie glukozy we krwi.



4. Metody oznaczania glukozy (metody enzymatyczne, metoda kondensacyjna o-toluidynowa, polarymetryczna, fermentacyjna, redukcyjna Nelsona).
LITERATURA:

  1. Ćwiczenia z biochemii” Leokadia Kłyszejko-Stefanowicz,

Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2003

  1. ”Biochemia Harpera” Robert K. Murray, Daryl K. Granner, Peter A. Mayes, Victor W. Rodwell, [(red.)] Franciszek Kokot

Wydawnictwo Lekarskie PZWL, Warszawa 2002, wyd. 5

  1. „Wybrane zagadnienia z biochemii ogólnej z ćwiczeniami” Teresa Kędryna, Maria Gałka-Walczak, Barbara Ostrowska

Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2001, wyd. 1






©snauka.pl 2016
wyślij wiadomość