Strona główna

Karbaminiany diamin w syntezie peptydomimetyków zawierających układ ureidowy”


Pobieranie 22.2 Kb.
Data19.06.2016
Rozmiar22.2 Kb.
12.03.2007 r.

mgr Anna Wiszniewska

Wydział Chemii UW

Pracownia Peptydów


Autoreferat rozprawy doktorskiej

KARBAMINIANY DIAMIN W SYNTEZIE PEPTYDOMIMETYKÓW ZAWIERAJĄCYCH UKŁAD UREIDOWY”

Promotor: prof. dr hab. Jan Izdebski
Peptydy biologicznie czynne cieszą się ogromnym zainteresowaniem przemysłu farmaceutycznego. Jednakże, stosowanie endogennych związków, jako leków, ograniczone jest ich biodostępnością, podawaniem doustnym oraz podatnością na degradację enzymatyczną. Rozwiązaniem tego problemu może być synteza związków imitujących działanie peptydów – peptydomimetyków. Wysiłki wielu grup badawczych zaowocowały syntezą dużej liczby nowych klas związków opartych na łańcuchu innym niż polipeptydowy. Przykładem takiej nowej klasy związków są oligomoczniki, w których wiązania amidowe zostały zastąpione układami ureidowymi.

Z przeglądu literatury dotyczącej syntezy związków oligomocznikowych na nośnikach polimerycznych wynikają pewne spostrzeżenia. Po pierwsze, monomery tworzące uzyskane związki można określić jako podstawione pochodne etylenodiaminy. Po drugie, w większości przypadków, aktywacja monomeru następuje poprzez utworzenie pochodnej kwasu węglowego, przy czym zastosowanie karbaminanów 4-nitrofenylowych lub O-sukcinimidowych posiada dodatkową zaletę polegającą na otrzymaniu monomerów do syntezy w formie krystalicznej. Po trzecie, syntezy opisane do tej pory w literaturze prowadzone były według strategii Fmoc lub z zastosowaniem innej grupy zasado-labilnej. Po czwarte, jak dotąd nie przeprowadzono żadnych badań odnośnie do wydajności sprzęgania otrzymanych monomerów. Po piąte, pomimo syntezy dużej liczby peptydomimetyków mocznikowych, tylko w nielicznych przypadkach przeprowadzono badania aktywności biologicznej otrzymanych związków.

Celem mojej pracy doktorskiej była ocena przydatności karbaminianów 4-nitrofenylowych oraz O-sukcinimidowych Boc-zabezpieczonych diamin jako reagentów pozwalających na wprowadzenie jednostek alkilomocznikowych do sekwencji peptydów, a także zbadanie możliwych reakcji ubocznych związanych z ich zastosowaniem. Duże znaczenie miało opracowanie takiej procedury, która byłaby kompatybilna z syntezą peptydów w fazie stałej, według strategii Boc, na żywicy aminowej typu BHA lub MBHA, gdyż takie podejście nie zostało dotąd opisane w literaturze. Końcowym etapem pracy było wykorzystanie otrzymanych karbaminianów w syntezie peptydomimetyków. Jako model do badań, postanowiłam wybrać enkefalinę, gdyż jest to peptyd o niewielkich rozmiarach, a jego aktywność biologiczna została dobrze poznana.

W ramach mojej pracy otrzymałam karbaminiany 4-nitrofenylowe i O-sukcinimidowe trzech mono Boc-zabezpieczonych diamin: etylenodiaminy (EDA), propylenodiaminy (PDA) i butylenodiaminy (BDA). Karbaminiany 4-nitrofenylowe i O-sukcinimidowe Boc-EDA oraz Boc-BDA wykorzystałam w syntezie związków zawierających powtarzające się ugrupowania alkilomocznikowe. Celem syntezy oligomoczników było: 1) opracowanie metody sprzęgania, 2) oszacowanie wydajności jednostkowej reakcji sprzęgania oraz 3) porównanie względnej reaktywności obu typów reagentów. Karbaminiany sprzęgałam w DMF, metodą będącą odpowiednikiem metody estrów aktywnych, stosowanej w syntezie peptydów. Sprzęganie karbaminianów O-sukcinimidowych prowadziłam w temperaturze pokojowej, natomiast sprzęganie karbaminianów 4-nitrofenylowych wymagało podwyższonej temperatury, ze względu na ich słabą rozpuszczalność w DMF. Do oszacowania wydajności reakcji sprzęgania wykorzystałam metodę spektrometrii mas. Wydajności sprzęgania uzyskane dla czterech wymienionych karbaminianów przedstawia poniższa tabela.




Karbaminian

Wydajność sprzęgania

karbaminian 4-nitrofenylowy Boc-EDA

ok. 96%

karbaminian O-sukcinimidowy Boc-EDA

ok. 85%

karbaminian 4-nitrofenylowy Boc-BDA

ok. 75%

karbaminian O-sukcinimidowy Boc-BDA

ok. 78%

Wymagania stawiane wydajności reakcji sprzęgania podczas syntezy peptydów lub ich analogów w fazie stałej są wysokie (rzędu 99%), gdyż w wyniku kumulacji błędu spada wydajność produktu końcowego. Uzyskane wydajności są co prawda niższe od wymaganych, jednakże w zupełności wystarczają do wprowadzenia jednej lub dwóch jednostek alkilomocznikowych do peptydu syntetyzowanego w fazie stałej.

Jednakże, na podstawie powyższych wyników, trudno jest wnioskować o relatywnej aktywności pochodnych 4-nitrofenylowych względem pochodnych O-sukcinimidowych. Różnica wydajności uzyskanej dla karbaminianów Boc-BDA jest na tyle niewielka, iż może mieścić się w granicach błędu. Natomiast, w przypadku karbaminianów Boc-EDA, porównanie aktywności zdecydowanie wypada na korzyść karbaminianu 4-nitrofenylowego, wobec czego w syntezie peptydomimetyków zdecydowałam się zastosować pochodne 4-nitrofenylowe.

Wprowadzenie układu ureidowego na początku syntetyzowanego łańcucha nie nastręcza większych problemów, gdyż można to osiągnąć poprzez zastosowanie odpowiedniego nośnika. Zgodnie z założeniami, w wyniku reakcji pomiędzy estrami aktywnymi kwasu węglowego i żywicą aminową typu BHA i MBHA tworzy się układ ureidowy, który można odszczepić się od nośnika za pomocą ciekłego HF po utworzeniu oligomeru.

Pomimo tego, w trakcie syntezy oligomoczników okazało się, iż nie da się zastosować standardowej metody usuwania grupy Boc, wykorzystującej 55% roztwór TFA w DCM. Początkowo przypuszczałam, że przyczyny należy szukać w metodzie odblokowania, gdyż po każdym przyłączeniu test ninhydrynowy wskazywał na brak wolnych grup aminowych. W związku z tym postanowiłam zastosować alternatywną metodę deprotekcji – 27% roztwór HCl w dioksanie. Zastosowanie tej metody przyniosło efekty w postaci usunięcia grupy zabezpieczającej, potwierdzone pozytywnym wynikiem testu ninhydrynowego, oraz syntezy oczekiwanych produktów. Synteza analogów enkefaliny spowodowała jednak, że musiałam zrewidować moje poglądy na temat źródła problemu związanego z zastosowaniem 55% TFA/DCM. Z jednej strony, odczynnika tego z powodzeniem użyłam do usuwania grupy Boc z aminokwasów, w przypadku gdy na C-końcu syntetyzowanego analogu znajdowało się wiązanie amidowe. Z drugiej strony, zastosowanie tego odczynnika podczas syntezy analogu zawierającego na C-końcu układ ureidowy zakończyło się niepowodzeniem. Jedynym wytłumaczeniem takich obserwacji mogło być to, iż C-końcowy układ ureidowy jest labilny w warunkach 55% TFA/DCM. Przeprowadzenie syntezy analogu zawierającego C-końcowy układ ureidowy z zastosowaniem alternatywnej metody deprotekcji, a następnie zadanie żywicy 55% TFA/DCM potwierdziło te przypuszczenia. Przeprowadzone eksperymenty wskazują, iż nawet w warunkach 27% roztworu HCl/dioksan, wiązanie pomiędzy żywicą a końcowym układem ureidowym jest stabilne, przy czym stężenie 18% w zupełności wystarcza, aby usunąć grupę zabezpieczającą. Opracowana metoda deprotekcji z wykorzystaniem roztworu HCl/dioksan do usuwania grupy t-butyloksykarbonylowej jest pierwszą metodą pozwalającą na syntezę analogów zawierających C-końcowy układ ureidowy w fazie stałej według strategii Boc na żywicy BHA lub MBHA. Dodatkowo, wprowadzenie układu ureidowego na C-końcu syntetyzowanego peptydu, eliminuje kłopotliwy proces odszczepiania peptydu od żywicy za pomocą ciekłego HF.

Wprowadzanie układu ureidowego na końcu oddalonym od żywicy wiąże się natomiast z reakcją uboczną, prowadzącą do otrzymania mieszaniny dwóch produktów: założonego produktu liniowego, zawierającego układ ureidowy na „N-końcu”, oraz cyklicznego mocznika. Badania, przeprowadzone dla wszystkich trzech diamin z udziałem węglanu bis(4-nitrofenylowego), wskazują, iż największy stopień cyklizacji zachodzi w przypadku etylenodiaminy (rzędu 68%), a najmniejszy w przypadku butylenodiaminy (rzędu 14%). Wyniki te są zgodne z oczekiwaniami, gdyż tworzenie się pierścieni pięcio- (EDA) i sześcioczłonowych (PDA) jest bardziej korzystne niż tworzenie się pierścieni siedmioczłonowych (BDA). Ponadto, zgodnie z przypuszczeniami, obecność trzeciorzędowej zasady w środowisku reakcji zwiększa stopień cyklizacji, przy czym najmniejszy wpływ zaobserwowano w przypadku butylenodiaminy, co również zgodne jest z oczekiwaniami. Badania, przeprowadzone w roztworze, wskazują natomiast, iż produkt cykliczny tworzy się już na etapie reakcji terminalnej grupy aminowej z węglanem bis(4-nitrofenylowym).

Opracowaną metodę wprowadzania układu alkilomocznikowego z udziałem pochodnych 4-nitrofenylowych wykorzystałam w syntezie peptydomimetyków. W mojej pracy przedstawiłam syntezę dziewięciu analogów [Leu5]enkefaliny oraz wyniki badań biologicznych dla siedmiu z nich. Cztery z otrzymanych pochodnych stanowiły analogi fragmentu 1-4 enkefaliny – najkrótszej sekwencji, która wykazuje aktywność biologiczną – zawierające od jednej do czterech jednostek etyloureidowych wbudowanych w miejsce reszt glicynowych, pomiędzy C-końcową resztę fenyloalaninową a N-końcową resztę tyrozynową. Badania biologiczne przeprowadzono dla analogów zawierających odpowiednio jedną i dwie jednostki etyloureidowe. Kolejne cztery pochodne to analogi [Leu5]enkefaliny, w których reszty glicynowe zastąpiono odpowiednio jedną jednostką etyloureidową, jedną jednostką propyloureidową, jedną jednostką butyloureidową oraz dwiema jednostkami etyloureidowymi. Zsyntetyzowałam również analog zawierający jednostkę etyloureidową na C-końcu peptydu. Wszystkie pięć analogów zbadano pod kątem aktywności biologicznej.


Analogi fragmentu 1-4 enkefaliny:

H-Tyr-NHCH2CH2NHCO-Phe-NH2

H-Tyr-(NHCH2CH2NHCO)2-Phe-NH2

H-Tyr-(NHCH2CH2NHCO)3-Phe-NH2

H-Tyr-(NHCH2CH2NHCO)4-Phe-NH2






Analogi [Leu5]enkefaliny:


H-Tyr-NHCH2CH2NHCO-Phe-Leu-NH2

H-Tyr-NHCH2CH2CH2NHCO-Phe-Leu-NH2

H-Tyr-NHCH2CH2CH2CH2NHCO-Phe-Leu-NH2

H-Tyr-(NHCH2CH2NHCO)2-Phe-Leu-NH2

H-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-NHCH2CH2NHCONH2

Wszystkie zmodyfikowane peptydy syntetyzowałam w fazie stałej na żywicy BHA (analogi fragmentu 1-4 enkefaliny) lub MBHA (pozostałe analogi) według strategii Boc. Aminokwasy sprzęgane były metodą karbodiimidową, z wykorzystaniem DCC (analogi fragmentu 1-4 enkefaliny) lub DIC (pozostałe analogi). Grupę zabezpieczającą usuwałam metodą standardową – 55% TFA/DCM, oprócz analogu zawierającego C-końcowy układ ureidowy, gdzie zastosowałam metodę alternatywną – roztwór HCl w dioksanie. We wszystkich przypadkach ugrupowanie alkilomocznikowe wprowadzałam za pomocą karbaminianu 4-nitrofenylowego odpowiedniej Boc-zabezpieczonej diaminy. Karbaminiany 4-nitrofenylowe Boc-zabezpieczonych diamin można więc z powodzeniem stosować do wprowadzania jednostek alkilomocznikowych metodą w pełni kompatybilną ze standardowym protokołem syntezy peptydów w fazie stałej.



Aktywność biologiczna niektórych z zsyntetyzowanych analogów, w porównaniu z aktywnością naturalnego peptydu, sugeruje, iż odpowiednie wprowadzenie tego typu modyfikacji do łańcucha peptydowego nie spowoduje znaczącej utraty czynności biologicznej. Układ ureidowy charakteryzuje się większą trwałością metaboliczną od wiązania peptydowego, wobec czego modyfikowane w ten sposób peptydy mogą stać się cennymi mimetykami naturalnych związków. Ponadto, opracowana metoda deprotekcji może stać się użytecznym narzędziem w syntezie peptydów zawierających na C-końcu układ ureidowy w fazie stałej na żywicy aminowej typu BHA i MBHA według strategii Boc.





©snauka.pl 2016
wyślij wiadomość