Zasady wykonywania i zaliczania ćwiczeń z biochemii



Pobieranie 66.32 Kb.
Data19.06.2016
Rozmiar66.32 Kb.
Zasady wykonywania i zaliczania ćwiczeń z biochemii


  1. Laboratorium Biochemii dla danej grupy odbywa się co dwa tygodnie. Na zajęcia należy zgłaszać się punktualnie; studenci spóźniający się nie będą dopuszczeni do wykonywania ćwiczenia.

  2. Studenci wykonują ćwiczenia wyłącznie w wyznaczonych terminach a ewentualne zmiany mogą być dokonywane tylko za zgodą kierownika pracowni.

  3. Wykonanie ćwiczenia wymaga przygotowania teoretycznego w zakresie określonym w wymaganiach do poszczególnych ćwiczeń. Daje to podstawy do prawidłowego wykonywania ćwiczenia i bardziej efektywnego wykorzystania czasu zajęć. Warunkiem przystąpienia do wykonywania ćwiczenia jest zaliczenie pisemnej wejściówki odbywającej się na początku każdej pracowni.

  4. Student może mieć maksymalnie dwa zaległe ćwiczenia, wynikające z usprawiedliwionej nieobecności lub niedopuszczenia do wykonywania ćwiczenia, w tym maksymalnie jedno z powodu niezaliczenia wejściówki. Odrabianie zaległych ćwiczeń odbywa się w terminach ustalonych z kierownikiem pracowni. Przewidziana jest również pracownia poprawkowa.

  5. W czasie przebywania w pracowni obowiązuje zachowanie porządku oraz przestrzeganie przepisów BHP.

  6. Na ćwiczeniach studenci otrzymują podstawowe wyposażenie obejmujące przyrządy laboratoryjne, odczynniki, szkło i drobny sprzęt jednorazowy. Ponadto studenci korzystają ze specjalnej, kosztownej aparatury tj. wirówka, spektrofotometr, pehametr, łaźnia wodna. Przy korzystaniu z aparatury należy bezwzględnie stosować się do wytycznych przekazywanych przez prowadzącego ćwiczenie.

  7. Po każdym ćwiczeniu student zobowiązany jest złożyć w ciągu 2 tygodni (najpóźniej na następnej pracowni) sprawozdanie, przygotowane na kartkach A4 zgodnie z wymaganiami opisanymi w instrukcji do danego ćwiczenia. Nieterminowe złożenie sprawozdania skutkuje obniżeniem jego oceny. Opisy zwrócone do poprawy należy poprawiać na bieżąco.

  8. Warunkiem zaliczenia Laboratorium Biochemii jest wykonanie i zaliczenie 6 ćwiczeń zasadniczego bloku ćwiczeniowego oraz ćwiczenia wstępnego.

  9. System oceniania

Każde ćwiczenie – 11 punktów :

    • wejściówka – 6 punktów

    • wykonanie i opis – 5 punktów (na obniżenie oceny ma wpływ m.in.. błędy w wykonaniu, nieterminowe oddanie opisu, opis niezgodny z wymaganiami, zwrot opisu do poprawy)

Sumarycznie można uzyskać 70 punktów:

  • 6 ćwiczeń x 11 punktów = 66 punktów

  • wejściówka do ćw. wstępnego = 4 punkty

Ocena końcowa:

3 od 42.0 punktów

3+ od 46.0 punktów

4 od 53.0 punktów

4+ od 60.0 punktów

5 od 66.5 punktów


Biochemia – laboratorium


kierownik: dr Marzena Jankowska – Anyszka
Przygotowane ćwiczenia (osoby prowadzące będą podane później):

Ćwiczenie wstępne: Bufory i odczynniki w badaniach biochemicznych


Ćwiczenie 1: Otrzymanie i badanie właściwości skrobi i glikogenu


Ćwiczenie 2: Lecytyny i cholesterol z żółtka jaj kurzego – izolacja i wykrywanie

Ćwiczenie 3: Właściwości reakcje aminokwasów

Ćwiczenie 4: Frakcjonowanie i oznaczanie białek mleka

Ćwiczenie 5: Badanie i oznaczanie aktywności amylazy ślinowej

Ćwiczenie 6: Kwasy nukleinowe – ćwiczenie w opracowaniu
Literatura do ćwiczeń (z wyjątkiem ćwiczenia wstępnego):


  1. „Ćwiczenia z biochemii” pod redakcja L. Kłyszejko – Stefanowicz

  2. „Biochemia” J. Berg, J. Tymoczko, L. Stryer lub l. Stryer lub dowolna inna

  3. Wykłady z „Biochemii”

Ćwiczenie wstępne: Bufory i odczynniki w badaniach biochemicznych


Wymagania:

  1. podstawowe wiadomości dotyczące roztworów buforowych (co to jest i jak działa bufor, pojemność buforowa, pH buforów)

  2. obliczanie pH buforów

Literatura:

  1. „Ćwiczenia z biochemii” pod redakcja L. Kłyszejko – Stefanowicz

  2. „Chemia ogólna” L. Jones, P. Atkins lub inna

Jest to ćwiczenie wstępne wykonywane na pierwszej pracowni, po omówieniu spraw organizacyjnych i wprowadzeniu do ćwiczeń. Po zaliczeniu wejściówki i krótkim wstępie dotyczącym buforów stosowanych w badaniach biochemicznych, studenci przygotowują określone bufory i wybrane odczynniki, które będą używane w trakcie ćwiczeń.



Ćwiczenie 1: Otrzymanie i badanie właściwości skrobi i glikogenu.
Wymagania:

  1. Mono-, di- i polisacharydy: budowa, występowanie i ogólna charakterystyka

  2. Właściwości redukujące cukrów oraz próby służące do ich wykrywania

  3. Reakcje barwne cukrów - zasada

Ćwiczenie wykonywane jest częściowo w zespołach dwuosobowych. Każdy zespół zobowiązany jest przynieść na zajęcia 1 ziemniak średniej wielkości, ok. 10 g wątróbki kurzej oraz tarkę kuchenną. Jedna osoba otrzymuje skrobię z ziemniaka, druga – glikogen z wątróbki. Badanie właściwości uzyskanych preparatów odbywa się wspólnie.



Otrzymanie skrobi z ziemniaka (wykonuje jedna osoba z zespołu)


Jeden niezbyt duży, obrany ziemniak zetrzeć na tarce do wytarowanego naczynia i zważyć. Dodać równą objętość wody (np. jeśli starty ziemniak ważył 40 g - dodać 40 cm3 wody), dobrze wymieszać i przesączyć przez kilka warstw gazy. Przesącz rozcieńczyć 2-3-krotnie wodą i pozostawić do dekantacji. Zlać płyn znad osadu, osad zawiesić w 4-5 cm3 etanolu i odsączyć na lejku Bűchnera. Pozostawić na lejku do wysuszenia, przenieść do wytarowanego naczynia i zważyć.

Przygotowanie kleiku skrobiowego


Zawiesić 0.5 g uzyskanej skrobi w 7 cm3 wody. W kolbie okrągłodennej zagotować 40 cm3 wody. Do gotującej wody wlać powoli, ciągle mieszając, zawiesinę skrobi. Uzyskany kleik przenieść do probówki Falcone na 50 cm3.

Otrzymanie glikogenu z wątroby (wykonuje druga osoba z zespołu)


10 g wątróbki kurzej umieścić w moździerzu, rozdrobnić i ucierać, dodając stopniowo piasek (ok. jednej łyżeczki). Następnie, ciągle ucierając, dodawać porcjami (po ok. 3 cm3) 5% roztwór kwasu trichlorooctowego (w sumie ok. 25 cm3). Homogenat przenieść, pozostawiając piasek na dnie, do probówek wirówkowych i odwirować przez 10 min. przy 4000 rpm. Do zebranego supernatantu dodać ok. 25 cm3 etanolu. Wytrącony glikogen odwirować przez 15 min. przy 4000 rpm. Delikatnie usunąć supernatant, a osad rozpuścić w niewielkiej ilości wody i finalnie rozcieńczyć go w probówce Falcone do 30 cm3.

Badanie właściwości skrobi i glikogenu

1. Reakcja skrobi i glikogenu z jodem

Odczynniki: roztwór skrobi (ok. 1%) i glikogenu (ok. 5 mg/cm3), 0.25% roztwór I2 w 1% KI, 1 M NaOH, 1 M HCl

Sprzęt: 2 szklane probówki, 5 pipetek plastikowych, palnik


  1. Do dwóch probówek wprowadzić po 1 cm3 kleiku skrobiowego (1) i roztworu glikogenu (2), a następnie dodać po 1-2 krople roztworu jodu. Obserwować powstałe zabarwienie.

  2. Probówki ogrzać w palniku, a następnie oziębić w strumieniu zimnej wody. Obserwować zmiany zabarwienia.

  3. Do probówek dodać po kropli 1 M roztworu NaOH, a następnie, również po kropli,
    1 M HCl. Obserwować zmiany zabarwienia.


2. Wytrącanie skrobi i glikogenu

Odczynniki: roztwór skrobi (ok. 1%) i glikogenu (ok. 5 mg/cm3), nasycony roztwór siarczanu amonu, ok. 96% etanol

Sprzęt: 4 szklane probówki, 4 dodatkowe pipetki plastikowe


  1. Do dwóch probówek wprowadzić po 1 cm3 roztworu: skrobi (1) i glikogenu (2). Dodać po 1 cm3 nasyconego roztworu siarczanu amonu i obserwować efekt reakcji.

  2. Do dwóch probówek wprowadzić po 1 cm3 roztworu: skrobi (1) i glikogenu (2). Dodać po 1 cm3 etanolu i obserwować efekt reakcji.


3. Reakcja Molischa

Odczynniki: roztwór skrobi (ok. 1%) i glikogenu (ok. 5 mg/cm3), 1% roztwór sacharozy,


1% roztwór galaktozy, 1% roztwór laktozy,

Sprzęt: 5 szklanych probówek, 6 dodatkowych pipetek plastikowych, łaźnia wodna


Do pięciu probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworu: galaktozy (1), laktozy (2), sacharozy (3), skrobi (4) i glikogenu (5). Dodać po 2 krople roztworu α-naftolu i wymieszać. Następnie ostrożnie i powoli wprowadzić po ściance skośnie ustawionych probówek 1 cm3 stęż. H2SO4. Obserwować zmiany zachodzące na granicy faz.
4. Hydroliza sacharozy, skrobi i glikogenu

Odczynniki: roztwór skrobi (ok. 1%) i glikogenu (ok. 5 mg/cm3), 1% roztwór sacharozy,


1 M NaOH, stęż. H2SO4

Sprzęt: 3 probówki Falcone 15 cm3, 2 dodatkowe pipetki plastikowe, łaźnia wodna


Do 3 probówek wprowadzić po 4 cm3 roztworu: skrobi (1), glikogenu (2) i sacharozy (3). Następnie dodać po 0.4 cm3 stęż. H2SO4 i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 10 min. Na koniec dodać do probówek po 4 cm3 1 M NaOH.
5. Reakcja Benedicta

Odczynniki: roztwór skrobi (ok. 1%) i glikogenu (ok. 5 mg/cm3), 1% roztwór sacharozy, roztwór skrobi, glikogenu i sacharozy po hydrolizie, 1% roztwór galaktozy,


1% roztwór laktozy, odczynnik Benedicta (1% wodny roztwór siarczanu miedzi zawierający węglan sodu (10 %) i cytrynian sodu (17 %))

Sprzęt: 8 szklanych probówek, 6 dodatkowych pipetek plastikowych, łaźnia wodna


Do ośmiu probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworu: galaktozy (1), laktozy (2), sacharozy (3), skrobi (4), glikogenu (5), oraz po 2 cm3 roztworu: sacharozy po hydrolizie (6), skrobi po hydrolizie (7) i glikogenu po hydrolizie (8). Dodać po 2 cm3 odczynnika Benedicta i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 min. Obserwować efekt reakcji.
6. Próba Tollensa

Odczynniki: roztwory cukrów jak wyżej, amoniakalny roztwór wododrotlenku srebra

Sprzęt: 8 szklanych probówek, 1 dodatkowa pipetka plastikowa, łaźnia wodna
Do ośmiu probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworu: galaktozy (1), laktozy (2), sacharozy (3), skrobi (4), glikogenu (5), oraz po 2 cm3 roztworu: sacharozy po hydrolizie (6), skrobi po hydrolizie (7) i glikogenu po hydrolizie (8). Dodać po 1 cm3 amoniakalnego roztworu wodorotlenku srebra i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej. Obserwować efekt reakcji.
7. Redukcja kwasu pikrynowego

Odczynniki: roztwory cukrów jak wyżej, nasycony roztwór kwasu pikrynowego, 2 M NaOH

Sprzęt: 8 szklanych probówek, 2 dodatkowe pipetki plastikowe, palnik
Do ośmiu probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworu: galaktozy (1), laktozy (2), sacharozy (3), skrobi (4), glikogenu (5), oraz po 2 cm3 roztworu: sacharozy po hydrolizie (6), skrobi po hydrolizie (7) i glikogenu po hydrolizie (8). Dodać po 1 cm3 nasyconego roztworu kwasu pikrynowego i 0.5 cm3 2 M NaOH. Ogrzać w palniku i obserwować efekt reakcji.
Opis ćwiczenia powinien zawierać:


  1. opis procedury otrzymania skrobi lub glikogenu wraz z krótkim uzasadnieniem wykonywania poszczególnych etapów

  2. omówienie wykonywanych prób według następującego schematu:

    • zasada, na której opiera się wykonanie oraz równanie reakcji (tak gdzie jest to możliwe)

    • obserwacje

    • wnioski

można również zastosować schemat: obserwacje, wnioski, wyjaśnienie, ale w każdym przypadku powyższe punkty maja być wyszczególnione!

Ćwiczenie 2: Lecytyny i cholesterol z żółtka jaja kurzego – izolacja i wykrywanie

Wymagania:



  1. Podstawowe grupy lipidów – ich budowa chemiczna oraz charakterystyka fizykochemiczna i biologiczna

  2. Podstawowe wiadomości dotyczące chromatografii cienkowarstwowej

Ćwiczenie wykonywane jest w zespołach dwuosobowych. Każdy zespół powinien przynieść 1 jajko kurze.


Izolacja lecytyny

Dokładnie oddzielić żółtko od białka i zalać je w zlewce 75 cm3 mieszaniny etanol – eter dietylowy (2:1, v/v). Rozmieszać żółtko szklaną bagietką i pozostawić mieszaninę w temperaturze pokojowej na ok. 10 min., od czasu do czasu mieszając. Mieszaninę odsączyć na sączku karbowanym do suchej kolby kulistej a przesącz odparować na wyparce (temperatura łaźni nie przekraczająca 50oC). Żółtą mazistą pozostałość rozpuścić w 10 cm3 eteru dietylowego. Otrzymany roztwór wkroplić powoli, mieszając, do zlewki zawierającej 30 cm3 acetonu. Wytrącony osad surowych lecytyn odsączyć na sączku karbowanym. Niewielką część osadu przenieść do probówki eppendorfa i zachować do analizy chromatograficznej. Pozostały osad rozpuścić w 20 cm3 etanolu i dodać 20 cm3 nasyconego etanolowego roztworu CdCl2 – wytrąca się trwały, krystaliczny związek addycyjny lecytyny z chlorkiem kadmu. Po paru minutach osad odsączyć.

Przesącz po wydzieleniu lecytyn odparować na wyparce (temperatura łaźni nie przekraczająca 50oC) a pozostałość zachować do analizy chromatograficznej.

Chromatografia cienkowarstwowa


Niewielkie próbki surowego ekstraktu lecytyn, kompleksu lecytyn z chlorkiem kadmu, pozostałości lipidów po wydzieleniu lecytyn oraz wzorca cholesterolu rozpuścić w chloroformie i nanieść kapilarą na płytkę chromatograficzną pokrytą żelem krzemionkowym. Płytki rozwinąć w dwóch układach: chloroform – metanol – woda (65:25:4) oraz toluen – octan etylu (7:3). Chromatogramy po rozwinięciu wysuszyć i wywołać w następujący sposób:

  1. spryskać 0.1% roztworem ninhydryny w etanolu i wstawić na parę minut do suszarki o temp. 120oC,

  2. spryskać 1% roztworem jodu w metanolu lub wstawić na kilka minut do komory z jodem,

  3. spryskać 5% roztworem kwasu siarkowego w etanolu i wstawić na kilka minut do suszarki o temp. 120oC.


Opis ćwiczenia powinien zawierać:

  1. opis procesu izolacji wraz z krótkim uzasadnieniem wykonywania poszczególnych etapów

  2. wyniki, analizę i wnioski z chromatografii cienkowarstwowej.


Ćwiczenie 3: Właściwości i reakcje aminokwasów

Wymagania:



  1. Ogólne wiadomości dotyczące aminokwasów (m.in. wzory, podział, własności amfoteryczne, punkt izoelektryczny i jego wyznaczanie, znaczenie biologiczne)

  2. Reakcje ogólne na aminokwasy i białka oraz ich zastosowanie

W ćwiczeniu zawarto przegląd reakcji charakterystycznych aminokwasów. Wykonujący przeprowadza je dla roztworów: wzorcowych aminokwasów, otrzymanego do zidentyfikowania aminokwasu oraz białka jaja kurzego (należy przynieść 1 jajo na całą grupę).



Przygotowanie roztworu białka jaja kurzego

Białko dokładnie oddzielić od żółtka, dodać 100 cm3 2% NaCl i wymieszać.


1. Reakcja ninhydrynowa

Odczynniki: 1% roztwór: glicyny, proliny, Gly-Gly, roztwór białka, otrzymany roztwór nieznanego aminokwasu; 1% roztwór ninhydryny w etanolu

Sprzęt: 6 probówek szklanych, statyw na probówki, 6 pipetek plastikowych, łaźnia wodna
Do sześciu probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworu: glicyny (1), proliny (2), Gly-Gly (3), białka (4), otrzymanego aminokwasu (5) oraz wodę (6). Dodać po 1 cm3 roztworu ninhydryny i ogrzewać we wrzącej łaźni przez 1 minutę. Obserwować zabarwienie.

2. Reakcja z kwasem azotowym(III) van Slyke’a

Odczynniki: 1% roztwór: glicyny i Gly-Gly, roztwór białka, otrzymany roztwór nieznanego aminokwasu, 10% roztwór NaNO2, 2 M roztwór CH3COOH

Sprzęt: 4 probówki szklane, 2 dodatkowe pipetki plastikowe
Do czterech probówek dodać po 2 cm3 10% NaNO2 i 2 cm3 2 M CH3COOH, zamieszać. Następnie dodać po 1 cm3 roztworu glicyny (1), Gly-Gly (2), białka (3) i badanej próbki aminokwasu (4). Obserwować zachodzące procesy.

3. Reakcja biuretowa Piotrowskiego

Odczynniki: 1% roztwór: glicyny, dowolnie wybranego aminokwasu, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, roztwór białka, otrzymany roztwór nieznanego aminokwasu, 6 M roztwór NaOH, 0.5% roztwór CuSO4

Sprzęt: 7 szklanych probówek, 3 dodatkowe pipetki plastikowe
Do sześciu probówek wprowadzić po 1 cm3 roztworu: glicyny (1), dowolnie wybranego aminokwasu (2), dipeptydu (3), tripeptydu (4), białka (5), otrzymanego do zidentyfikowania aminokwasu (6) oraz wodę(7). Dodać po 2 cm3 6 M NaOH i jednej kropli 0.5% CuSO4 – dobrze wymieszać. Następnie dodać kroplami pozostałe 0.5 cm3 CuSO4. Obserwować zabarwienie.

4. Wykrywanie obecności siarki w cysteinie i cystynie (reakcja cystynowa)

Odczynniki: 1% roztwór: glicyny, cysteiny, cystyny, metioniny, roztwór białka, roztwór otrzymanego do zidentyfikowania aminokwasu, 6 M roztwór NaOH,


1% roztwór (CH3COO)2Pb

Sprzęt: 7 szklanych probówek, 4 dodatkowe pipetki plastikowe, łaźnia wodna


Do siedmiu probówek wprowadzić po 1 cm3 roztworu glicyny (1), cysteiny (2), cystyny (3), metioniny (4), otrzymanego aminokwasu (5), białka (6) i wody (7). Dodać po 2 cm3 6 M NaOH i 0.5 cm3 1% octanu ołowiu(II). Ogrzewać kilkanaście minut we wrzącej łaźni wodnej i obserwować zmiany.

5. Reakcja z nitroprusydkiem sodu na obecność cysteiny

Odczynniki: 1% roztwór: glicyny, cysteiny, cystyny, metioniny, roztwór białka, roztwór otrzymanego do zidentyfikowania aminokwasu, 1% roztwór nitroprusydku sodu, siarczan amonu, stęż. NH3

Sprzęt: 7 probówek szklanych, 2 dodatkowe pipetki plastikowe, łopatka metalowa
Do siedmiu probówek wprowadzić po 1 cm3 roztworu: glicyny (1), cysteiny (2), cystyny (3), metioniny (4), otrzymanego aminokwasu (5), białka (6) i wody (7). Dodać po 1 cm3 roztworu nitroprusydku, nasycić siarczanem(VI) amonu i wkroplić stężony amoniak. Obserwować zmiany zabarwienia.

6. Wykrywanie metioniny metodą McCarthy-Sullivana

Odczynniki: 1% roztwory: glicyny, metioniny, cysteiny, roztwór białka, roztwór aminokwasu do identyfikacji, 40% NaOH, 10% roztwór nitroprusydku sodu, stężony HCl.

Sprzęt: 5 probówek szklanych, 3 dodatkowe pipetki plastikowe, zlewka
Do pięciu probówek wprowadzić po 2.5 cm3 roztworu metioniny (1), cysteiny (2), białka (3), aminokwasu do identyfikacji (4) i wody (5). Następnie dodać po: 0.5 cm 3 40% NaOH (wymieszać), 0.5 cm3 1% roztworu glicyny (wymieszać) i 0.3 cm3 10% nitroprusydku sodu. Próbki ogrzewać przez 10 minut w temperaturze 40-80oC (może być w zlewce z ciepłą wodą), nie dopuszczając do wrzenia. Następnie oziębić je pod kranem i dodać po ok. 0.5 cm3 stężonego roztworu HCl. Obserwować zmianę barwy.

7. Reakcja ksantoproteinowa

Odczynniki: 1% roztwory: glicyny, tyrozyny, tryptofanu, aminokwasu do zidentyfikowania, roztwór białka, stężony kwas azotowy, 6 M roztwór NaOH

Sprzęt: 7 szklanych probówek, 3 dodatkowe pipetki plastikowe, łaźnia wodna
Do siedmiu probówek wprowadzić po 1 cm3 roztworów: glicyny (1), tyrozyny (2), tryptofanu (3), białka (4), aminokwasu do zidentyfikowania (5) oraz wodę (6). Dodać po 1 cm3 stężonego kwasu azotowego i ogrzewać mieszaniny przez kilka minut we wrzącej łaźni wodnej. Następnie probówki ostudzić i OSTROŻNIE (REAKCJA SILNIE EGZOTERMICZNA !) dodać po 3 cm3 6 M NaOH. Obserwować zmiany barwy.

8. Reakcja Pauly’ego na obecność histydyny i tyrozyny

Odczynniki: 1% roztwory: glicyny, histydyny, tyrozyny, roztwór białka, otrzymany roztwór aminokwasu do identyfikacji, 1% roztwór kwasu sulfanilowego w 1 M HCl,


5% roztwór NaNO2, 10% roztwór Na2CO3.

Sprzęt: 7 szklanych probówek, 4 dodatkowe pipetki plastikowe


Do 2 cm3 1 % kwasu sulfanilowego dodać 2 cm3 5% azotanu(III) sodu. Zawartość probówki wstrząsać przez kilka minut, jednocześnie chłodząc ją pod bieżącą wodą. Następnie do sześciu probówek rozdzielić po 0.5 cm3 powyższego odczynnika, dodać po 1 cm3 10% węglanu sodu i po 0.5 cm3 odpowiednio roztworów: glicyny (1), histydyny (2), tyrozyny (3), otrzymanego do identyfikacji aminokwasu (4), białka (5) oraz wodę (6). Obserwować zmianę barwy (może nastąpić dopiero po kilku minutach).

9. Reakcja Voiseneta na obecność tryptofanu

Odczynniki: 1% roztwory: glicyny, tryptofanu, roztwór białka, otrzymany roztwór aminokwasu do identyfikacji, 2.5% roztwór aldehydu mrówkowego, stężony HCl, 0.05% roztwór NaNO2

Sprzęt: 5 szklanych probówek, 3 dodatkowe probówki plastikowe
Do pięciu probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworów: glicyny (1), tryptofanu (2), aminokwasu do zidentyfikowania (3), białka (4) oraz wodę (5). Następnie dodać kroplę roztworu aldehydu mrówkowego oraz 4 cm3 stężonego HCl i pozostawić na 5 minut. Po tym czasie dodawać powoli kroplami roztwór azotanu(III) sodu. Obserwować zmianę barwy.

10. Reakcja Sakaguchi’ego na obecność argininy

Odczynniki: 1% roztwory: glicyny, argininy, roztwór białka, otrzymany roztwór aminokwasu do identyfikacji, 10% roztwór NaOH, 1% roztwór α-naftolu w etanolu, roztwór NaOBr

Sprzęt: 5 szklanych probówek, 4 dodatkowe pipetki plastikowe
Do pięciu probówek wprowadzić odpowiednio po 1 cm3 roztworów: glicyny (1), argininy (2), aminokwasu do zidentyfikowania (3), białka (4) oraz wodę (5). Następnie dodać kolejno po 0.5 cm3 10% NaOH, 2-3 krople roztworu naftolu i kroplę roztworu NaOBr. Obserwować zmianę barwy.

Opis ćwiczenia powinien zawierać:


  1. omówienie wykonywanych reakcji według następującego schematu:

    1. zasada, na której opiera się próba (+ równanie reakcji, tak gdzie jest to możliwe)

    2. obserwacje

    3. wnioski (dotyczące związków, dla których była wykonywana próba oraz aminokwasu, otrzymanego do identyfikacji)

  2. propozycję schematu identyfikacji związku w próbie (białko, peptyd, aminokwasy) w oparciu o wykonywane reakcje barwne.

.

Ćwiczenie 4: Frakcjonowanie i oznaczanie białek mleka

Wymagania:



  1. Klasyfikacja i budowa białek

  2. Właściwości białek w roztworze: amfoteryczność, zdolność tworzenia roztworów koloidalnych, rozpuszczalność, wysalanie, denaturacja, właściwości optyczne

  3. Metody oznaczania ilościowego białek

Ćwiczenie wykonywane jest w zespołach dwuosobowych. Każdy zespół powinien przynieść 25 cm3 mleka.


Frakcjonowanie białek mleka metodą wysalania


Do 25 cm3 lekko ogrzanego mleka dodać powoli, mieszając, 10 cm3 1% kwasu octowego. Wytrącony osad kazeiny odsączyć na lejku karbowanym. Odmierzyć pipetą automatyczną
3 cm3 przesączu (UWAGA – należy pamiętać o zmierzeniu całkowitej objętości zebranej serwatki!) do probówki wirówkowej i dodać równą objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu. Wytrącony osad globulin odwirować przez 5 min. przy 5000 rpm. Usunąć delikatnie pipetką pasteurowską supernatant przenosząc go do następnej probówki wirówkowej, zaś osad globulin zachować do oznaczenia ilościowego. Do supernatantu dodawać małymi porcjami stały siarczan amonu do wysycenia (ok. 1-1.5 g; na dnie powinno zostać trochę nierozpuszczonych kryształków). Wytrącony osad albumin odwirować przez 5 min. przy 5000 rpm. Usunąć delikatnie pipetką pasteurowską supernatant, zaś osad zachować do oznaczenia ilościowego.
Oznaczenie globulin i albumin mleka metodą Bradforda

Odczynniki: 0.9% NaCl, roztwór bydlęcej immunoglobuliny G o stężeniu 1.11 μg/μl, roztwór albuminy surowicy ludzkiej o stężeniu 1.98 μg/μl, koncentrat odczynnika barwiącego Bio-Rad Protein Assay

Sprzęt: probówki eppendorfa, statywy, pipety automatyczne 1-10 μl, 10-100 μl , 100-1000 μl wraz z końcówkami, pipetki pasteurowskie, kuwety z polistyrenu, spektrofotometr

1. Krzywa wzorcowa

Do probówek eppendorfa zawierających po 1000 μl 0.9% roztworu NaCl dodać 2, 4, 6, 8, 10 i 12 μl wzorcowego roztworu: bydlęcej immunoglobuliny G o stężeniu 1.11 μg/μl i albuminy surowicy ludzkiej o stężeniu 1.98 μg/μl - dobrze wymieszać. Następnie przenieść po 800 μl powyższych roztworów do nowych probówek eppendorfa i dodać do nich po 200 μl odczynnika Bio-Rad Protein Assay, wymieszać i pozostawić na ok. 15 minut. Zmierzyć absorbancję w 595 nm wobec próby kontrolnej (800 μl 0.9% NaCl + 200 μl odczynnika Bio-Rad Protein Assay).


2. Oznaczenie globulin i albumin

Osady globulin i albumin otrzymane podczas frakcjonowania białek mleka rozpuścić w 5 cm3 0.9% roztworu NaCl (w razie potrzeby, w przypadku globulin, przenieść roztwór z osadem do kolby miarowej na 50 lub 100 cm3 i dopełnić do kreski roztworem 0.9% NaCl). Przygotować w probówkach eppendorfa po 1000 μl odpowiednio rozcieńczonych roztworów białek: 20-krotnie w przypadku roztworu globulin (zakładając, że udało się je rozpuścić w 5 cm3) i 40-krotnie w przypadku roztworu albumin. Do rozcieńczania użyć 0.9 % NaCl.

Następnie przenieść po 800 μl powyższych roztworów białek do probówek eppendorfa i dodać do nich po 200 μl odczynnika Bio-Rad Protein Assay, wymieszać i pozostawić na ok. 15 minut. Zmierzyć absorbancję w 595 nm wobec próby kontrolnej (800 μl 0.9% NaCl + 200 μl odczynnika Bio-Rad Protein Assay). Zawartość białka w próbie odczytać z krzywej wzorcowej.

Opis ćwiczenia powinien zawierać:


  1. opis procesu frakcjonowania białek mleka wraz z krótkim uzasadnieniem wykonywania poszczególnych etapów

  2. krótkie omówienie zasady, na której opiera się oznaczanie białek metodą Bradforda

  3. oszacowanie zawartości albumin i globulin w mleku:

    • wykreślić krzywą wzorcową dla bydlęcej immunoglobuliny G oraz albuminy surowicy ludzkiej

    • na podstawie krzywych wzorcowych wyznaczyć zawartość albumin i globulin w próbkach

    • oszacować procentową zawartość albumin i globulin w mleku.



Ćwiczenie 5: Badanie i oznaczanie aktywności amylazy ślinowej

Wymagania:



  1. Budowa chemiczna enzymów

  2. Klasyfikacja enzymów

  3. Mechanizm działania enzymów

  4. Właściwości kinetyczne enzymów: kinetyka Michaelisa - Menten, oznaczanie aktywności, czynniki warunkujące aktywność (temperatura, pH, obecność aktywatorów i inhibitorów), inhibicja odwracalna (kompetycyjna i niekompetycyjna) i nieodwracalna

Ćwiczenie polega na przeprowadzeniu reakcji stopniowego rozkładu skrobi przez amylazę ślinową, wyznaczeniu warunków pH i temperatury, w których amylaza wykazuje największą aktywność wobec skrobi jako substratu oraz oznaczeniu aktywności tego enzymu metodą Wohlgemuta. Ćwiczenie wykonywane jest w dwuosobowych zespołach.


Przygotowanie roztworu śliny

Usta przepłukać wodą destylowaną, chwilę poczekać i zebrać 2 cm3 śliny do probówki falcone 15. Zebraną ślinę rozcieńczyć 5-krotnie wodą destylowaną.


1. Stopniowy rozkład skrobi przez amylazę ślinową

Odczynniki: roztwór śliny, 1% roztwór skrobi (o temperaturze 37oC) , 0.0025% roztwór I2 w KI

Sprzęt: 1 probówka falcone 50, 15 probówek szklanych, statyw na probówki, 3 pipetki plastikowe, łaźnia wodna, stoper

Do probówki falcone 50 cm3 wprowadzić 1 cm3 roztworu śliny i 9 cm3 wody destylowanej. Probówkę wstawić do łaźni wodnej o temperaturze 37oC na parę minut. W tym czasie przygotować statyw z probówkami szklanymi, do których należy dodać po 1 cm3 roztworu jodu.

Po osiągnięciu przez roztwór śliny temperatury 37oC, wlać do niego 10 cm3 1% roztworu skrobi inkubowanego w tej samej temperaturze, zamieszać, pobrać pipetką plastikową 1 cm3 mieszaniny i dodać do pierwszej probówki z jodem.

Mieszaninę reakcyjną (skrobia + ślina) inkubować w łaźni w temperaturze 37oC. Co 30 sek. pobierać po 1 cm3 hydrolizatu i dodawać do kolejnej probówki z jodem. Jeśli barwa w trzech pierwszych probówkach nie wykazuje wyraźnej zmiany, hydrolizat pobierać co minutę.



2. Określenie optymalnego pH dla aktywności amylazy

Odczynniki: roztwór śliny, 1% roztwór skrobi (o temperaturze 37oC), 0.0025% roztwór I2 w KI, bufor cytrynianowo - fosforanowy o pH 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5

Sprzęt: 3 probówki falcone 50 cm3 , 3 x 20 probówek szklanych, 3 statywy na probówki,
3 pipetki plastikowe, łaźnia wodna, stoper
Do trzech probówek falcone 50 cm3 dodać po 1 cm3 roztworu śliny i 9 cm3 buforów o trzech różnych wartościach pH wskazanych przez prowadzącego ćwiczenie. Probówki inkubować w temperaturze 37oC przez parę minut (w tym czasie przygotować probówki zawierające po 1cm3 roztworu jodu) a następnie dodać do nich po 10 cm3 roztworu skrobi o tej samej temperaturze. Włączyć stoper. Pobierać co 2 minuty kolejno po 1 cm3 hydrolizatu z mieszanin o różnym pH i dodawać je do probówek z jodem. W przypadku braku widocznej zmiany lub zbyt szybkiej zmiany barwy we wszystkich trzech szeregach probówek skorygować odstęp czasu, w którym pobierany jest hydrolizat.

3. Określenie optymalnej temperatury dla aktywności amylazy

Odczynniki: roztwór śliny, 1% roztwór skrobi (o temperaturze 20oC, 37oC i 45oC), 0.0025% roztwór I2 w KI

Sprzęt: 3 probówki falcone 50 cm3 , 3 x 20 probówek szklanych, 3 statywy na probówki, 3 pipetki plastikowe, łaźnia o temperaturze 20, 37 i 45oC, stoper
Do trzech probówek falcone 50 cm3 dodać po 1 cm3 roztworu śliny i 9 cm3 wody destylowanej. Probówki inkubować w trzech różnych temperaturach przez parę minut (w tym czasie przygotować probówki zawierające po 1cm3 roztworu jodu) a następnie dodać do nich po 10 cm3 roztworu skrobi o tej samej temperaturze. Włączyć stoper. Pobierać co 1 minutę kolejno po 1 cm3 hydrolizatu z mieszanin o różnych temperaturach i dodawać je do probówek z jodem. W przypadku braku widocznej zmiany lub zbyt szybkiej zmiany barwy we wszystkich trzech szeregach probówek skorygować odstęp czasu, w którym pobierany jest hydrolizat.

4. Oznaczenie aktywności amylazy ślinowej metodą Wohlgemuta

Odczynniki: roztwór śliny, 0.1% roztwór skrobi, 0.25% roztwór I2 w KI, bufor cytrynianowo - fosforanowy o pH wyznaczonym w punkcie 2



Sprzęt: 1 probówka falcone 15 cm3, 10 probówek szklanych, statyw na probówki, pipetka szklana, łaźnia wodna o temperaturze wyznaczonej w punkcie 3

Przygotowanie roztworu śliny: usta przepłukać wodą destylowaną, chwilę poczekać i zebrać 1-2 cm3 śliny do probówki falcone 15 cm3. Zebraną ślinę rozcieńczyć 5-krotnie buforem o odpowiednim pH..
Przygotować w statywie 10 probówek i oznakować je numerami od 1 do 10. Do probówki #1 dodać 4 cm3 przygotowanego roztworu śliny. Do pozostałych dziewięciu probówek dodać po 2 cm3 buforu. Następnie przygotować serię rozcieńczeń roztworu śliny pobierając z probówki #1 2 cm3 roztworu i przenosząc go do probówki #2, z której, po dokładnym (ale delikatnym!) wymieszaniu, pobieramy 2 cm3 roztworu i przenosimy do kolejnej probówki. Procedurę powtórzyć do probówki #10, z której pobrane 2 cm3 roztworu wylewamy. Probówki inkubować w temperaturze wyznaczonej w punkcie 3 przez parę minut a następnie dodać do każdej z nich po 2 cm3 0.1% roztworu skrobi, wymieszać i pozostawić w tej samej temperaturze na 30 minut. Po tym czasie do każdej probówki dodać po kropli 0.25% roztworu jodu i obserwować zmianę barwy.

Opis ćwiczenia powinien zawierać:

  1. omówienie wykonywanych eksperymentów według następującego schematu:

    • zasada, na której opiera się wykonanie

    • obserwacje

    • wnioski

  1. obliczenie aktywności amylazy. W stosowanej metodzie za jednostkę aktywności przyjmuje się taką ilość amylazy, która w czasie 30 minut rozkłada do stadium achrodekstryn (nie dające już zabarwienia z jodem) 1 mg skrobi. Wynik podać w cm3 0.1% roztworu skrobi rozłożonej w czasie 30 minut przez 1 cm3 śliny.





©snauka.pl 2019
wyślij wiadomość

    Strona główna
Komunikat prasowy
przedmiotu zamówienia
najkorzystniejszej oferty
Informacja prasowa
wyborze najkorzystniejszej
warunków zamówienia
istotnych warunków
sprawie powołania
Regulamin konkursu
udzielenie zamówienia
przetargu nieograniczonego
zamówienia publicznego
Nazwa przedmiotu
Specyfikacja istotnych
modułu kształcenia
Rozporządzenie komisji
studia stacjonarne
wyborze oferty
Zapytanie ofertowe
Szkolny zestaw
Ochrony rodowiska
ramach projektu
prasowy posiedzenie
trybie przetargu
obwodowych komisji
zagospodarowania przestrzennego
komisji wyborczych
komisji wyborczej
Program konferencji
Wymagania edukacyjne
Lista kandydatów
szkoły podstawowej
która odbyła
Województwa ląskiego
Decyzja komisji
przedmiotu modułu
poszczególne oceny
Sylabus przedmiotu
szkół podstawowych
semestr letni
Postanowienia ogólne
przedsi biorców
produktu leczniczego
Karta przedmiotu
Scenariusz lekcji
Lista uczestników
Program nauczania
Projekt współfinansowany
Informacje ogólne
biblioteka wojewódzka
semestr zimowy